王 婷，田迎櫻，李雪靜，王 菲，王靜鳳,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266003）

我國(guó)是世界第一水產(chǎn)大國(guó)，據(jù)2017年中國(guó)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，我國(guó)養(yǎng)殖和捕撈魚(yú)類(lèi)總產(chǎn)量達(dá)6 446萬(wàn) t[1]。魚(yú)類(lèi)在加工過(guò)程中大約會(huì)產(chǎn)生30%～50%包括魚(yú)卵在內(nèi)的加工的重要副產(chǎn)物，魚(yú)卵中富含多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸/二十二碳六烯酸、糖蛋白、卵磷脂等多種功效成分[2-3]。然而目前除少量?jī)?yōu)質(zhì)魚(yú)卵被用來(lái)加工為腌漬魚(yú)卵、魚(yú)子醬等初級(jí)形式食品外，大部分未被高值化利用。造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[4-5]。本課題組前期通過(guò)追蹤前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖活性，從14 種水產(chǎn)魚(yú)卵中篩選出了一種新型的鯽魚(yú)卵唾液酸糖蛋白（sialoglycoproteins ofCarassiusauratuseggs，Ca-SGP)[6]，并闡明了其結(jié)構(gòu)輪廓和生物活性。

Ca-SGP是由分子質(zhì)量為10.87 kDa的唾液酸糖肽（Ca-SGPP）重復(fù)連接而成的，N-糖鏈通過(guò)β-N-乙酰氨基葡萄糖連接在肽鏈N端4位的天冬酰胺上，由4 條支鏈構(gòu)成，各支鏈存在分支鏈結(jié)構(gòu)，其糖鏈末端的唾液酸為Neu5Ac，Neu5Ac通過(guò)α(2→3)糖苷鍵連接在糖鏈末端半乳糖上[7]；Xia Guanghua等[8-9]對(duì)其活性研究發(fā)現(xiàn)Ca-SGP在細(xì)胞水平上可以促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化和礦化，同時(shí)可以抑制破骨細(xì)胞的成熟和分化；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ca-SGP可以抑制去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨吸收，減少骨丟失；Mao Lei等[10]發(fā)現(xiàn)Ca-SGP可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化；周曉春等[11]發(fā)現(xiàn)Ca-SGP對(duì)免疫力低下的小鼠具有調(diào)節(jié)作用；Wang Fei等[12]發(fā)現(xiàn)Ca-SGP能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥型骨折小鼠早期軟骨骨痂的形成、中期軟骨骨痂向骨性骨痂的轉(zhuǎn)化以及后期骨性骨痂的重建，從而加速骨折愈合。然而，Ca-SGP屬于大分子物質(zhì)，其如何通過(guò)胃腸道被降解并利用仍不清楚。

近年來(lái)，體外消化模型因其簡(jiǎn)單、廉價(jià)、可重復(fù)性高、可實(shí)現(xiàn)多樣本同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于藥物劑型分解、營(yíng)養(yǎng)成分生物利用度、物質(zhì)消化等研究中[13]。體外胃腸模擬系統(tǒng)能夠有效解決胃腸道消化研究常存在的倫理問(wèn)題，且廣泛應(yīng)用于研究機(jī)體胃腸道對(duì)食物或藥物的消化行為[14-15]。該系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)合適的消化酶濃度、pH值、消化時(shí)間、鹽濃度及其他因子，最大程度地模擬體內(nèi)口腔、胃、小腸及大腸的生理?xiàng)l件。因此，本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)胃腸模擬模型，在體外體系中對(duì)Ca-SGP進(jìn)行胃腸液消化及腸道菌群厭氧發(fā)酵，通過(guò)對(duì)Ca-SGP降解產(chǎn)物的分析探究其在消化道內(nèi)的降解情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

3月齡SPF 級(jí)健康雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200.0±2.0）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0001，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

Ca-SGP干粉由中國(guó)海洋大學(xué)夏光華博士提供。在冰浴條件下迅速取出成熟的雌性鯽魚(yú)（Carassius auratus）魚(yú)卵，剔除魚(yú)卵包膜，然后稱(chēng)取100 g魚(yú)卵用均質(zhì)機(jī)破碎，加入3.8 倍體積的NaCl（0.38 mol/L）溶液，攪拌4.2 h。提取液5 000 r/min離心10 min除雜后，加入等體積的90%苯酚溶液，攪拌2 h。離心得到的上清液用截留分子質(zhì)量10 kDa的透析袋流水透析3 d，蒸餾水透析1 d。將離心后所得的上清液凍干即制得Ca-SGP粗品。本實(shí)驗(yàn)采用陰離子交換樹(shù)脂單步純化Ca-SGP粗品所得，純度為84.6%，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.55%的Neu5Ac，分子質(zhì)量為195.35 kDa，不含磷。Ca-SGP的結(jié)構(gòu)輪廓如圖1所示。

圖 1 Ca-SGP結(jié)構(gòu)輪廓Fig. 1 Structure of Ca-SGP

胃蛋白酶、胰酶、唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品（Neu5AC）、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；豬膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；鄰苯二胺鹽酸鹽 美國(guó)BBI公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純） 德國(guó)Merck公司；牛血清白蛋白、Folin-酚試劑、L-抗壞血酸 上海索萊寶生物科技有限公司；牛肉粉 北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；胰蛋白胨 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠(chǎng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-QSynthesis超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；SHZ-82A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器 上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1200高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱美國(guó)Aglient公司；TSK-GELG4000PWxl色譜柱 日本TOSOH公司；BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-2450分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 胃腸液配制

人工胃腸消化液儲(chǔ)備液配制參照Minekus等[16]的方法，具體配方見(jiàn)表1。

表 1 人工胃腸液儲(chǔ)備液配制Table 1 Preparation of simulated gastrointestinal fluids

1.3.2 胃腸消化條件

準(zhǔn)確稱(chēng)取60 mg的Ca-SGP樣品溶于20 mL超純水中。取10 mL樣品水溶液，加入8 mL人工胃液（simulated gastric fluid，SGF）儲(chǔ)備液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至2.0。然后加入100 mg胃蛋白酶、5 μL 0.3 mol/L的CaCl2，最后加超純水補(bǔ)至20 mL，作為胃消化組；取10 mL樣品，加入10 mL超純水，作為胃消化對(duì)照組；取10 mL超純水，加入8 mL SGF儲(chǔ)備液，調(diào)pH值至2.0，加入與胃消化組等量的酶和CaCl2，作為胃消化基質(zhì)對(duì)照組。在37 ℃恒溫振蕩箱內(nèi)進(jìn)行消化，消化結(jié)束后調(diào)pH值至中性滅酶。取胃消化后產(chǎn)物10 mL，加入8 mL人工腸液（simulated intestinal fluid，SIF）儲(chǔ)備液，調(diào)pH值至7.0，加入60 mg胰酶、136 mg豬膽鹽、20 μL CaCl2，用超純水補(bǔ)至20 mL，作為腸消化組；取胃消化實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組10 mL，加入等體積的水作為小腸消化實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組；取胃消化實(shí)驗(yàn)中的基質(zhì)對(duì)照組10 mL，加入與腸消化組等量的SIF儲(chǔ)備液、胰酶、豬膽鹽和CaCl2，作為小腸消化實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)對(duì)照組。置于37 ℃恒溫振蕩箱內(nèi)進(jìn)行消化，消化結(jié)束后煮沸滅酶。

1.3.3 厭氧培養(yǎng)基配制及菌懸浮液制備

厭氧培養(yǎng)基參照Z(yǔ)hou Jing等[17]的方法進(jìn)行配制。取37.5 mL A溶液（含1.18%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）NaCl、0.47% KH2PO4、0.12% CaCl2、1.2% (NH4)SO4、0.25% MgSO4· H2O）、37.5mL溶 液B（0.78% K2HPO4）、2 mLL-抗壞血酸（25%）、0.5gL-半胱氨酸、2 mL Na2CO3（8%）、1 g牛肉粉、1 g胰蛋白胨，加超純水補(bǔ)至1 L。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.5～8.0，隨后加入0.05gL-半胱氨酸鹽酸鹽。無(wú)菌條件下取出健康大鼠的結(jié)腸內(nèi)容物，稱(chēng)取1.0 g內(nèi)容物于離心管中，加入10 mL無(wú)菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，靜置片刻，用無(wú)菌槍頭搗碎，充分漩渦振蕩。懸濁液在1 500 r/min條件下離心5 min，取上清液置于新管中再次離心，重復(fù)2 次，得腸道菌懸液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.3.4 腸道菌群發(fā)酵條件

在厭氧管中充入高純N2，加入5 mL培養(yǎng)基，加塞密封，121 ℃條件下高壓滅菌。用無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液配制質(zhì)量濃度為15 mg/mL的Ca-SGP溶液，過(guò)0.45 μm無(wú)菌水系濾膜。在無(wú)菌操作臺(tái)上用1 mL的注射器在裝有培養(yǎng)基的各厭氧管管內(nèi)分別注入0.5 mL樣品和0.5 mL菌懸液。將各厭氧管置于37 ℃恒溫振蕩箱分別發(fā)酵0、6、12、24 h和48 h。發(fā)酵結(jié)束后，立即放在-80 ℃冰箱內(nèi)終止反應(yīng)。

1.3.5 消化樣品分子質(zhì)量測(cè)定

取適量消化后的樣品，過(guò)0.45μm 水系濾膜，采用高效空間排阻色譜法（high-performance sizeexclusion chromatography，HPSEC）測(cè)定樣品的分子質(zhì)量。采用分子質(zhì)量為5、12、50、270 kDa的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。HPSEC條件為：色譜柱：TSK-GELG4000PWxl（30 cm×7.8 mm，10 μm）；流動(dòng)相：0.2 mol/L NaCl溶液；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器（230 nm）。

為排除酸性條件（pH 2）電解質(zhì)對(duì)Ca-SGP分子質(zhì)量的影響，將Ca-SGP分別于pH 2.0的樣品水溶液、儲(chǔ)備液（加入0.3 mol/L CaCl2）中消化6 h，檢測(cè)消化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量。

1.3.6 消化樣品還原糖質(zhì)量濃度測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicyclic acid，DNS）法測(cè)定消化后樣品的還原糖質(zhì)量濃度。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）于試管中，用蒸餾水補(bǔ)齊至2 mL；消化后樣品用蒸餾水5 倍體積稀釋。各管加入1.4 mL的DNS試劑，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確加熱5 min，取出，冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，加塞混勻，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.7 消化樣品唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將消化后的樣品用8 kDa的透析袋透析3 d，每6 h換一次水。取1 mL透析后的樣品，加入1 mL 0.5 mol/L的NaHSO4，在80 ℃水浴鍋中水解30 min，冷卻。將Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配成500 μg/mL的儲(chǔ)備液，然后梯度稀釋成500、200、100、10、1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)體系。然后取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和酸解后的樣品溶液，加入1 mL的20 mg/mL鄰苯二胺鹽酸鹽0.25 mol/L的NaSO4溶液配制），在80 ℃水浴鍋中衍生40 min，冷卻后過(guò)無(wú)菌0.22 μm的濾膜，置于4 ℃冰箱中保存。然后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定樣品消化后剩余唾液酸的含量。HPLC色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：1.0%四氫呋喃溶液（含0.2%磷酸）-乙腈（98∶2，V/V）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（227 nm）。

1.3.8 消化樣品蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定胃腸消化后的蛋白質(zhì)量濃度。稱(chēng)取10 g Na2CO3、2 g NaOH、0.25 g酒石酸鉀鈉，用蒸餾水定容至500 mL，作為A液；稱(chēng)取0.5 g CuSO4·5H2O，用蒸餾水定容至100 mL，作為B液。試劑A和B以50∶1（V/V）混勻，得到試劑甲。試劑乙為Folin-酚試劑。配制250 μg/mL的牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水補(bǔ)足至1 mL；消化后的樣品經(jīng)8 kDa透析袋透析后，取1 mL。各濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品分別加入5 mL試劑甲，混勻，室溫靜置10 min。再加入0.5 mL試劑乙，迅速漩渦混勻，室溫靜置30 min，于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca-SGP最適胃腸消化時(shí)間的確定

為了確定胃消化的最適時(shí)間，首先將胃消化時(shí)間設(shè)置為2、4、6 h，采用HPSEC法檢測(cè)胃消化不同時(shí)間后分子質(zhì)量的變化。如圖2A所示，胃消化基質(zhì)液的出峰時(shí)間與樣品水溶液的出峰時(shí)間不一致，表明胃消化基質(zhì)液對(duì)樣品分子質(zhì)量變化無(wú)干擾。如圖2B所示，與對(duì)照組相比，胃消化后樣品峰右移，說(shuō)明樣品的分子質(zhì)量減小，且在6 h偏移最大。

取胃消化6 h后的樣品進(jìn)行下一步的小腸消化，同時(shí)設(shè)置小腸消化時(shí)間為2、4、6 h，采用HPSEC法檢測(cè)小腸不同消化時(shí)間后分子質(zhì)量的變化。如圖3A所示，小腸消化基質(zhì)液的出峰時(shí)間與樣品水溶液的出峰時(shí)間不一致，可排除胃消化基質(zhì)液對(duì)樣品分子質(zhì)量變化的干擾。如圖3B所示，與對(duì)照組相比，小腸消化后樣品峰右移，說(shuō)明樣品的分子質(zhì)量減小，在2 h偏移最大且再延長(zhǎng)小腸消化時(shí)間分子質(zhì)量基本不變。綜上所述，胃消化最適時(shí)間為6 h，小腸消化最適時(shí)間為2 h。

圖 2 Ca-SGP在胃消化2、4、6 h后分子質(zhì)量的變化Fig. 2 Change in olecular mass of Ca-SGP after gastric digestion for 2, 4 and 6 h

圖 3 Ca-SGP在小腸消化2、4、6 h后分子質(zhì)量的變化Fig. 3 Change in molecular mass of Ca-SGP after intestinal digestion for 2, 4 and 6 h

2.2 胃腸消化對(duì)Ca-SGP分子質(zhì)量的影響

采用HPSEC法測(cè)定胃消化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量。如圖4A所示，經(jīng)胃消化6 h后，樣品峰右移，Ca-SGP分子質(zhì)量由（194.78±10.31）kDa減小到（155.00±13.59）kDa，說(shuō)明胃對(duì)Ca-SGP有一定的消化作用。將Ca-SGP的胃消化產(chǎn)物進(jìn)行小腸消化2 h，如圖4B所示，Ca-SGP的胃消化產(chǎn)物經(jīng)小腸消化后，分子質(zhì)量進(jìn)一步減小，平均減小到（38.94±2.26）kDa，說(shuō)明小腸對(duì)Ca-SGP有較明顯的消化作用。

圖 4 胃腸消化對(duì)Ca-SGP分子質(zhì)量的影響Fig. 4 Effect of gastric and intestinal digestion on molecularmass of Ca-SGP

圖 5 pH值和電解質(zhì)對(duì)Ca-SGP消化的影響Fig. 5 Effect of pH and electrolytes on the digestion of Ca-SGP

有研究表明，pH值和鹽類(lèi)會(huì)造成大分子的解聚和斷裂[18]。為了研究pH值對(duì)Ca-SGP分子質(zhì)量的影響，在不加入消化酶的情況下，將Ca-SGP置于pH 2.0的樣品水溶液中消化6 h，采用HPSEC法測(cè)定消化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量。如圖5所示，與樣品水溶液相比，Ca-SGP在pH 2.0的條件下消化后的分子質(zhì)量并沒(méi)有發(fā)生改變。為了研究鹽類(lèi)對(duì)Ca-SGP分子質(zhì)量的影響，將Ca-SGP于鹽溶液中消化6 h，檢測(cè)消化后產(chǎn)物的分子質(zhì)量，如圖5所示，與樣品水溶液相比，Ca-SGP在鹽溶液中消化6 h后產(chǎn)物分子質(zhì)量并沒(méi)有發(fā)生變化。因此，pH值和電解質(zhì)對(duì)Ca-SGP在胃腸消化無(wú)影響，說(shuō)明Ca-SGP分子質(zhì)量的減小是因?yàn)橄傅淖饔谩?/p>

2.3 胃腸消化對(duì)Ca-SGP蛋白質(zhì)量濃度的影響

Ca-SGP中含有14.33%的蛋白，采用Folin-酚法檢測(cè)了胃和小腸消化后樣品中蛋白質(zhì)量濃度的變化。如圖6所示，與對(duì)照組相比，消化后樣品的蛋白質(zhì)量濃度無(wú)顯著降低，推測(cè)胃和小腸對(duì)Ca-SGP的蛋白部分無(wú)消化作用。但不排除是因?yàn)橄褐写罅康鞍酌傅拇嬖谑瓜昂髽悠返牡鞍踪|(zhì)量濃度變化被掩蓋。

圖 6 胃腸消化對(duì)Ca-SGP蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effect of gastric and intestinal digestion on protein content of Ca-SGP

2.4 胃腸消化對(duì)Ca-SGP還原糖質(zhì)量濃度的影響

圖 7 胃腸消化對(duì)Ca-SGP還原糖質(zhì)量濃度的影響Fig. 7 Effect of gastric and intestinal digestion on reducing sugar content of Ca-SGP

多糖易在水相體系中形成聚合物，有時(shí)很難區(qū)分聚合物分子質(zhì)量的改變是由于聚合物的解聚還是由于分子鏈共價(jià)鍵的斷裂[19]。若分子質(zhì)量的降低是由于糖苷鍵斷裂引起，則還原末端的量將增加[20]，因此采用DNS法測(cè)定了Ca-SGP經(jīng)胃腸消化后還原糖的變化。如圖7所示，胃消化6 h后，還原糖質(zhì)量濃度極顯著增加，小腸繼續(xù)消化2 h后，還原糖質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加，因此，推測(cè)Ca-SGP經(jīng)胃腸消化后分子質(zhì)量的減小是糖苷鍵的斷裂所致。

2.5 胃腸消化對(duì)Ca-SGP唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

胃腸消化酶理論上可以消化α-糖苷鍵，Ca-SGP糖鏈末端的Neu5Ac以α(2→3)糖苷鍵連接在半乳糖上。為了研究胃腸消化對(duì)唾液酸的影響，采用HPLC-UV法檢測(cè)Ca-SGP經(jīng)胃腸消化后唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。如圖8所示，與對(duì)照組相比，Ca-SGP經(jīng)胃消化后，唾液酸有部分丟失且質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低17.53%（P＜0.05），小腸消化后唾液酸大量丟失，質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低71.94%（P＜0.01）。因此，胃腸消化能夠使Ca-SGP上的唾液酸脫落。由Ca-SGP的N-糖鏈的結(jié)構(gòu)輪廓（圖9）可知，糖鏈的支鏈與主鏈之間以α(1→3)糖苷鍵連接，也容易受到胃腸酶的作用，因此，被消化下來(lái)的Neu5Ac是游離的、帶支鏈的，還是兩者均有仍需進(jìn)一步探討。

潮州麥稈畫(huà)作品中所蘊(yùn)含的歷史文化內(nèi)涵，是潮州麥稈畫(huà)區(qū)別于其它地區(qū)麥稈畫(huà)作品的重要因素，潮州麥稈畫(huà)精良的制作技藝與深刻的文化內(nèi)涵，使潮州麥稈畫(huà)有別具一格的藝術(shù)表現(xiàn)力與藝術(shù)感染力。在體現(xiàn)歷史文化內(nèi)涵方面，風(fēng)景題材的麥稈畫(huà)作品是其中的翹楚，與傳統(tǒng)的花鳥(niǎo)麥稈畫(huà)作品不同，風(fēng)景題材的作品更具地域特色，通過(guò)對(duì)潮州特定景觀(guān)進(jìn)行取景創(chuàng)作而成的潮州麥稈畫(huà)作品，具有獨(dú)特的潮州歷史文化內(nèi)涵。

圖 8 胃腸消化對(duì)Ca-SGP唾液酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 8 Effect of gastric and intestinal digestion on Neu5Ac content of Ca-SGP

圖 9 Ca-SGP的N-糖鏈結(jié)構(gòu)輪廓Fig. 9 Structure of N-glycan chain of Ca-SGP

2.6 發(fā)酵過(guò)程中Ca-SGP分子質(zhì)量的變化

上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ca-SGP經(jīng)胃和小腸消化后分子質(zhì)量減小，其Ca-SGP糖鏈末端的Neu5Ac可以被脫除。然而Ca-SGP的糖鏈大多以β-糖苷鍵連接，胃腸消化酶只能作用于α-糖苷鍵，因此Ca-SGP會(huì)進(jìn)入大腸進(jìn)行下一步的降解。使用健康小鼠的腸道菌懸液對(duì)Ca-SGP進(jìn)行厭氧發(fā)酵，采用HPSEC法分別檢測(cè)了發(fā)酵0、6、12、24、48 h后Ca-SGP的分子質(zhì)量，如圖10所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品峰不斷右移且峰值下降，說(shuō)明Ca-SGP的分子質(zhì)量減小且含量降低。提示腸道菌群可以降解Ca-SGP，并同時(shí)利用其降解產(chǎn)物。如圖11定量結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵后，Ca-SGP分子質(zhì)量由195.69 kDa降到34.77 kDa。

圖 10 發(fā)酵不同時(shí)間后Ca-SGP的分子質(zhì)量變化Fig. 10 Change in molecular mass of Ca-SGP after fermentation for different periods

圖 11 發(fā)酵不同時(shí)間后Ca-SGP的分子質(zhì)量Fig. 11 Change in molecular mass of Ca-SGP after fermentation for different durations

2.7 發(fā)酵過(guò)程中Ca-SGP還原糖質(zhì)量濃度和pH值的變化

圖 12 發(fā)酵不同時(shí)間后Ca-SGP的還原糖質(zhì)量濃度和pH值變化Fig. 12 Change in reducing sugar content of Ca-SGP and change in pH after fermentation for different durations

采用DNS法測(cè)定了Ca-SGP經(jīng)發(fā)酵后還原糖的變化，如圖12所示，Ca-SGP經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后，還原糖質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低。還原糖質(zhì)量濃度沒(méi)有因糖鏈的裂解而升高，說(shuō)明Ca-SGP能夠不斷被微生物發(fā)酵并且利用。

pH值的變化可作為發(fā)酵過(guò)程中的指示劑，用pH計(jì)檢測(cè)了發(fā)酵0、6、12、24、48 h后溶液的pH值。如圖12所示，溶液最初的pH值為7.77，呈弱堿性，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值不斷降低，48 h后降到6.26，呈現(xiàn)弱酸性。有研究表明pH值的降低是由多糖發(fā)酵引起的，與短鏈脂肪酸的產(chǎn)生有關(guān)[21-22]。因此，推測(cè)本研究中pH值的降低是由腸道菌群發(fā)酵利用Ca-SGP，產(chǎn)生短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)引起的。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在體外水平對(duì)鯽魚(yú)卵唾液酸糖蛋白的胃腸和菌群發(fā)酵的降解產(chǎn)物進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，胃腸液對(duì)Ca-SGP有一定的降解作用，Ca-SGP糖鏈末端的活性因子唾液酸能夠在胃腸消化酶的作用下發(fā)生脫落；大腸腸道菌群能夠進(jìn)一步降解Ca-SGP并利用其降解產(chǎn)物。

本研究中，Ca-SGP經(jīng)歷胃和小腸消化后分子質(zhì)量減小，推測(cè)胃和小腸消化后Ca-SGP的蛋白鏈和糖鏈發(fā)生變化。由2.3節(jié)可知，Ca-SGP經(jīng)胃和小腸消化后蛋白質(zhì)量濃度無(wú)顯著降低，推測(cè)胃和小腸對(duì)Ca-SGP的蛋白部分無(wú)消化作用。靜態(tài)胃腸模擬模型中參與消化蛋白質(zhì)的是胃蛋白酶和胰蛋白酶，胃蛋白酶優(yōu)先作用于酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸殘基所組成的肽鍵[23]，胰蛋白酶專(zhuān)一作用于精氨酸及賴(lài)氨酸殘基所組成的肽鍵[24]。Ca-SGP含有天冬氨酸/天冬酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸8 種氨基酸，氨基酸殘基數(shù)目之比約為2∶2∶1∶2∶1∶1∶1[25]。Ca-SGP經(jīng)過(guò)胃消化后蛋白質(zhì)含量變化不大，推測(cè)是因?yàn)镃a-SGP的蛋白鏈上連接了大量的糖鏈，阻礙了胃蛋白酶的作用位點(diǎn)，且Ca-SGP不含胃蛋白酶優(yōu)先作用的氨基酸殘基形成的肽鍵。將胃消化產(chǎn)物進(jìn)行下一步的小腸消化后蛋白質(zhì)的變化不大，說(shuō)明胰蛋白酶對(duì)Ca-SGP中的蛋白質(zhì)無(wú)消化作用，推測(cè)是因?yàn)镃a-SGP不含胰蛋白酶作用的氨基酸殘基形成的肽鍵。此外Ca-SGP的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.33%，因體外胃腸模擬模型中存在大量的胃蛋白酶和胰蛋白酶，故并不能排除實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅旧韺?duì)樣品蛋白質(zhì)變化的干擾。

Ca-SGP經(jīng)歷胃和小腸消化后分子質(zhì)量減小，推測(cè)是因?yàn)樘擒真I的斷裂。胃和小腸消化后還原糖質(zhì)量濃度的增加進(jìn)一步證明了上述推測(cè)。在Ca-SGP的糖鏈中，末端的Neu5Ac以α(2→3)糖苷鍵連接在半乳糖上，支鏈與主鏈之間以α(1→3)糖苷鍵連接，這兩處連接位點(diǎn)可能受到消化酶的作用。胃和小腸消化后Neu5Ac的含量減少約71%，說(shuō)明末端Neu5Ac可以被脫除。前期研究結(jié)果顯示，小鼠單次灌胃Ca-SGP后0.5 h內(nèi)，Neu5Ac可快速進(jìn)入小腸腸壁，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值，血清中Neu5Ac的質(zhì)量分?jǐn)?shù)自灌胃后持續(xù)增加，并在5 h時(shí)達(dá)到峰值。提示Ca-SGP的活性因子Neu5Ac可以被小腸吸收，進(jìn)入血液循環(huán)[26]。小腸消化后，Ca-SGP的分子質(zhì)量大幅度減小，推測(cè)主鏈與支鏈之間的糖苷鍵也會(huì)發(fā)生斷裂，因此Ca-SGP的糖鏈在經(jīng)歷胃和小腸消化后產(chǎn)生的碎片可能包括主鏈、支鏈、Neu5Ac、支鏈+Neu5Ac。Wang Cong等[27]發(fā)現(xiàn)體內(nèi)內(nèi)源性蛋白酶（唾液酸酶、胰蛋白酶）只能消化殼聚糖中的α-糖苷鍵，對(duì)β-糖苷鍵幾乎不能分解或者少量分解。因Ca-SGP的糖鏈大多以β-糖苷鍵連接，受限于胃腸道的消化，因此會(huì)進(jìn)入大腸受到腸道菌群的降解和發(fā)酵。在體外模擬腸道菌群發(fā)酵時(shí)，由于培養(yǎng)基的消耗及代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)菌不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，因此通常不宜超過(guò)48 h[28]。本研究將發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為0、6、12、24 h和48 h，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，Ca-SGP的分子質(zhì)量和水平均不斷減小，且還原糖質(zhì)量濃度及pH值呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)，說(shuō)明腸道菌群在裂解Ca-SGP的同時(shí)利用了其降解產(chǎn)物。這一研究結(jié)果與秦清娟等[29]發(fā)現(xiàn)腸道菌群能夠降解并利用魔芋葡甘低聚糖相似。

綜上所述，胃腸液對(duì)Ca-SGP有一定的消化作用，胃腸消化酶能夠使Ca-SGP糖鏈上的唾液酸脫落。大腸腸道菌群能夠裂解Ca-SGP并利用其降解產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)在體外水平上研究了Ca-SGP在胃腸和腸道菌群的降解作用，為深入探索Ca-SGP作用機(jī)理提供了理論支撐。