刁翠茹，王 靜，閆 勇，劉 東，張曉寒，王 浩

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

高脂血癥主要是指血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）或甘油三酯（triglyceride，TG）水平升高[1]。大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血脂水平、血漿膽固醇水平升高程度與動脈粥樣硬化及高脂血癥的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系，特別是與冠心病、腦中風(fēng)、心腦血管疾病的死亡率呈正相關(guān)[2-4]。而心血管疾病仍然是全球人類死亡的主要原因，在美國所有患病死亡的患者中，約1/3死于心血管疾病[5]。肝臟是合成與分解TG的重要場所，當(dāng)脂肪合成與分解失衡或代謝運(yùn)轉(zhuǎn)異常，超于機(jī)體可控調(diào)節(jié)范圍時，就會引起TC、TG水平升高，進(jìn)一步誘發(fā)高脂血癥[6]。

蝦青素是一種葉黃素類胡蘿卜素，存在于許多微生物、海洋動物、酵母和鳥類羽毛中，被認(rèn)為是生物圈中分布最廣泛的脂溶性葉黃素[7-9]。蝦青素不僅可以抑制脂質(zhì)過氧化和低密度脂蛋白氧化，還可以減少高脂膳食飼喂大鼠中血清TG含量[9-11]。蝦青素已被證明具有多種生物學(xué)功能，如抗脂質(zhì)過氧化和抗炎等[12-14]。研究表明，蝦青素的抗氧化性能有助于預(yù)防癌癥、糖尿病和心血管疾病[13-14]。其抗氧化活性高于大多數(shù)抗氧化劑，包括VC、VE、β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素[15]。目前國內(nèi)外研究集中于蝦青素對酒精性脂肪肝的預(yù)防[16-17]，而對HepG2細(xì)胞降血脂功能的研究尚鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以高脂HepG2細(xì)胞及高脂膳食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠為模型，探討蝦青素對血脂代謝的影響，為蝦青素在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6J小鼠40 只，體質(zhì)量（20±2）g，許可證號：No.11400700309252，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

蝦青素油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.64%） 云南愛爾康生物技術(shù)有限公司；TC、TG測定試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；TRIzol試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green染料 寶生物工程（大連）有限公司；引物 蘇州金唯智生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、MyiQ2實(shí)時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Multiskan-FC型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾儀器（上海）有限公司；752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；Neofuge冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；G-box凝膠圖像采集分析系統(tǒng) 英國Syngene公司；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中脂滴含量的測定

細(xì)胞培養(yǎng)及種板操作參考實(shí)驗(yàn)室已有方法[18]，細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)24 h貼壁；棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗一次，選取4、8、16 μmol/L蝦青素為藥物處理終濃度，選取誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪堆積的油酸終濃度為250 μmol/L，同時處理12 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS潤洗兩次，加入終質(zhì)量濃度為2 mg/L油紅O染色40 min，PBS潤洗3 次，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照；每孔加入1 mL異丙醇溶解，將孔內(nèi)溶液全部轉(zhuǎn)于1.5 mL EP管中，取1 mL異丙醇溶液作對照，于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度反映脂滴含量。

1.3.2 HepG2細(xì)胞中TG、TC含量的測定

細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)24 h貼壁，選取4、8、16 μmol/L蝦青素為藥物處理終濃度，選取誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪堆積的油酸終濃度為250 μmol/L，同時處理12 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗一次，細(xì)胞刮刀小心刮除細(xì)胞并溶于1 mL PBS中，混勻，離心（1 000 r/min、10 min），棄上清液，留細(xì)胞沉淀，用PBS清洗兩次，重復(fù)離心；收集細(xì)胞沉淀溶于0.3 mL PBS中，冰浴條件下超聲破碎（功率300 W、5 s/次、間隔30 s，重復(fù)5 次），勻漿。制備好的細(xì)胞樣品按照TG、TC說明書加樣，酶標(biāo)儀測定吸光度[19]。

1.3.3 動物分組和飼喂

適應(yīng)一周后將小鼠隨機(jī)分成4 組，每組10 只，分別為正常組、高脂組、低劑量蝦青素組和高劑量蝦青素組。動物飼料組成見表1。

動物飼養(yǎng)條件： 屏障系統(tǒng)動物房， 溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，控制照明12 h/12 h晝夜循環(huán)。小鼠飼養(yǎng)8 周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食攝水。實(shí)驗(yàn)動物每2 d更換新糧。實(shí)驗(yàn)8 周后，小鼠禁食不禁水12 h，CO2麻醉后取血、處死并解剖。血液4 ℃離心分離血清后-80 ℃保存。收集臟器，生理鹽水清洗后-80 ℃保存。結(jié)腸內(nèi)容物裝入已滅菌離心管中，-80 ℃保存。

表 1 C57BL/6J小鼠飼料組成Table 1 Ingredients of diets for C57BL/6J mice g

1.3.4 血清中TC、TG和HDL-C水平的測定

血清中TC、TG和HDL-C濃度的測定參照試劑盒說明書進(jìn)行，分別通過膽固醇氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法、甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法和直接法-過氧化氫酶清除法測定。非HDL-C濃度為TC與HDL-C濃度的差值。

1.3.5 病理學(xué)檢測

取相同位置肝臟，放入盛有體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液的標(biāo)本瓶中固定。24 h后將固定的肝組織脫水，石蠟包埋并切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，先后用伊紅、蘇木精染色和復(fù)染，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片，用顯微鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測肝臟中脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)水平

TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，-80 ℃保存。SYBRGreen法檢測基因表達(dá)水平，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參基因，根據(jù)美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物（表2）。反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR參照試劑盒具體說明進(jìn)行。具體操作方法參考文獻(xiàn)[20]。

表 2 C57BL/6J小鼠肝臟中與脂肪合成相關(guān)基因PCR引物Table 2 PCR primers for genes related to lipid synthesis in C57BL/6J mouse liver

1.3.7 糞中短鏈脂肪酸的測定

取每只小鼠新鮮糞便，以2-乙基丁酸作為內(nèi)標(biāo)，4 ℃放置過夜，加入濃硫酸酸化，再次漩渦振蕩，混勻后加入乙醚萃取，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)到另一離心管中，加入無水硫酸鈉，10 000×g離心30 min，取上層進(jìn)行氣相色譜分析。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）測定的前處理方法參見文獻(xiàn)[21]。氣相色譜條件：FID檢測器、19091N-133 HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素對油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)脂滴含量的影響

圖 1 蝦青素對油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的影響（400×）Fig. 1 Effect of astaxanthin on the content of lipid droplets in HepG2 cells induced by oleic acid (400 ×)

圖 2 各實(shí)驗(yàn)組的吸光度Fig. 2 Absorbance of five cell groups

由圖1、2可以看出，經(jīng)油紅O染色后，胞內(nèi)脂滴呈紅色，250 μmol/L油酸處理的細(xì)胞內(nèi)脂滴含量明顯增多，染色后油酸高脂組中細(xì)胞異丙醇溶液的吸光度是正常組的3.67 倍，脂肪積累極顯著增加（P＜0.01）；8、16 μmol/L蝦青素組極顯著降低油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂滴含量（P＜0.01），吸光度相比于油酸高脂組分別降低41.13%和53.25%，證實(shí)蝦青素能有效抑制油酸誘導(dǎo)的脂滴沉積。

2.2 蝦青素對油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的影響

圖 3 蝦青素對油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量的影響Fig. 3 Effect of astaxanthin on TG and TC contents in oleic acid induced HepG2 cells

由圖3可見，與正常組相比，油酸高脂組細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量極顯著升高（P＜0.01）；與油酸高脂組相比，經(jīng)蝦青素處理后細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量極顯著降低，且呈濃度依賴趨勢，其中16 μmol/L蝦青素組TG、TC含量分別降低69.19%和63.69%（P＜0.01），表明蝦青素能夠明顯抑制油酸誘導(dǎo)的胞內(nèi)TG、TC含量的增加。

2.3 蝦青素對C57BL/6J小鼠體質(zhì)量、攝食量及臟器質(zhì)量的影響

表 3 C57BL/6J小鼠體質(zhì)量、攝食量及臟器質(zhì)量（n＝10）Table 3 Body mass, feed intake and viscera mass of C57BL/6J mice in four groups (n= 10)

由表3可知，C57BL/6J小鼠飼喂8 周后，高脂組小鼠攝食量略低于正常組小鼠攝食量。但各組小鼠初始體質(zhì)量、最終體質(zhì)量及攝食量均無顯著性差異（P＞0.05）。與正常組相比，高脂組小鼠的肝臟質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01）；與高脂組比，高劑量蝦青素組肝臟質(zhì)量顯著降低20.28%（P＜0.05）。

2.4 蝦青素對C57BL/6J小鼠血脂水平的影響

表 4 蝦青素對C57BL/6J小鼠血脂水平的影響（n＝10）Table 4 Effect of astaxanthin on serum lipid levels in C57BL/6J mice (n= 10)

由表4可知，高脂組的小鼠血清TC、TG、非HDL-C水平較正常組均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而HDL-C水平極顯著低于正常組（P＜0.01）。從血清TC水平看，與高脂組相比，蝦青素兩個劑量組的TC水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），高劑量蝦青素降低TC水平效果更明顯，使TC水平顯著降低30.1%。從血清TG水平看，與高脂組相比，蝦青素兩個劑量組的TG水平都顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并且高劑量蝦青素組降低TG水平比低劑量蝦青素組提高10.6%，從血清HDL-C水平看，高劑量蝦青素組的HDL-C水平極顯著高于高脂組（P＜0.01），是高脂組的1.84 倍，說明蝦青素能升高小鼠血清中HDL-C水平。從血清非HDL-C水平看，與高脂組相比，低、高劑量蝦青素組的非HDL-C水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），分別降低了27.5%和42.2%。

2.5 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞形態(tài)的影響

圖 4 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞形態(tài)的影響（200×）Fig. 4 Effect of astaxanthin on hepatocyte morphology of C57BL/6J mice (200 ×)

由圖4可知，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，少見脂肪變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，肝小葉內(nèi)和血管周圍無炎癥細(xì)胞聚集；高脂組小鼠肝組織出現(xiàn)大面積脂肪變性，部分肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大脂滴，細(xì)胞核被較大的脂滴擠到一側(cè)；與高脂組相比，高劑量蝦青素組小鼠肝組織脂肪變性減輕，胞漿內(nèi)脂滴數(shù)量減少、體積變小。正常組肝小葉結(jié)構(gòu)正常且肝細(xì)胞排列整齊，與高劑量蝦青素組無明顯差異。高脂飲食導(dǎo)致小鼠肝脂肪變性，肝細(xì)胞中細(xì)胞壞死的數(shù)量增加且出現(xiàn)大量的脂肪空泡，使其明顯增大。結(jié)果表明，蝦青素能夠干預(yù)逆轉(zhuǎn)高脂引起的肝脂肪變性。

2.6 蝦青素對C57BL/6J小鼠糞中SCFAs的影響

圖 5 蝦青素對C57BL/6J小鼠糞便中SCFAs的影響Fig. 5 Effect of astaxanthin on fecal short-chain fatty acid level in C57BL/6J mice

對糞便樣品中3 種主要的SCFAs（乙酸、丙酸和丁酸）進(jìn)行測定。由圖5可知，與正常組相比，高脂飲食誘導(dǎo)的3 種主要的SCFAs含量和總SCFAs含量均極顯著降低（P＜0.01），蝦青素干預(yù)后，3 種主要SCFAs的含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。并且高劑量蝦青素組乙酸、丙酸和丁酸的水平分別是高脂組的1.31、1.44 倍和1.47 倍。高劑量蝦青素組主要SCFAs的生成量是高脂組的1.40 倍。

2.7 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝臟中與脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

圖 6 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝臟中基因SREBP-1C、FAS、PPARa mRNA和CPT-1 mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of astaxanthin on the mRNA expression levels of genes related to lipid synthesis in C57BL/6J mouse liver

由圖6可知，F(xiàn)AS是內(nèi)源性脂肪酸合成的限速酶，在控制脂肪酸合成中具有重要作用。與高脂組相比，高劑量蝦青素干預(yù)組FASmRNA和SREBP-1CmRNA相對表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01），高劑量蝦青素組PPARαmRNA和CPT-1mRNA相對表達(dá)量提高。

3 討 論

血脂水平異常是動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，因此將血脂水平維持在正常范圍對心血管疾病的預(yù)防和治愈有著重要意義[22]。研究表明高脂膳食會導(dǎo)致血脂異常，提高血清中TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇水平[23-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂膳食會引起肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血清中TG水平增加，并在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，誘導(dǎo)肝臟中脂肪變性，給予一定劑量的蝦青素可以降低血清中TC、TG、非HDL-C水平，顯著升高HDL-C水平，對于調(diào)節(jié)血脂水平具有重要作用，并且通過降低脂肪含量改善由高脂膳食誘導(dǎo)的肝損傷。

此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示蝦青素能夠顯著降低細(xì)胞中脂肪含量和膽固醇水平。通過對肝臟中與脂肪相關(guān)基因表達(dá)水平的分析，可以看出高脂飲食導(dǎo)致FASmRNA和SREBP-1CmRNA表達(dá)水平顯著升高，給予蝦青素干預(yù)后逆轉(zhuǎn)這種改變。與高脂組的表達(dá)水平相比，F(xiàn)AS是催化脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，添加蝦青素干預(yù)，F(xiàn)ASmRNA表達(dá)及其代表的內(nèi)源性脂肪酸合成受到抑制[25]。SREBP-1C是調(diào)控TG合成相關(guān)的靶基因，并且能激活脂質(zhì)合成[26]。與高脂組相比，蝦青素下調(diào)SREBP-1C基因及其靶基因FAS的表達(dá)，進(jìn)而減少血清中內(nèi)TG水平。CPT-1是脂肪酸β氧化的限速酶[27]，在脂肪代謝中發(fā)揮重要作用。PPARα是調(diào)控CPT-1mRNA表達(dá)的上游基因，PPARα被高脂飲食激活后將誘導(dǎo)CPT-1mRNA的表達(dá)，增加CPT-1的合成，促進(jìn)脂肪酸β氧化，減少脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)的沉積，減輕肝細(xì)胞的脂肪變性[28]。結(jié)果顯示，高劑量蝦青素組小鼠的PPARαmRNA和CPT-1mRNA的表達(dá)增高，說明肝細(xì)胞在高脂飲食的誘導(dǎo)下，增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸β氧化，減輕肝細(xì)胞的脂肪性變。

SCFAs對能量代謝的多重影響已經(jīng)被證明，SCFAs從腸腔被運(yùn)輸?shù)剿拗鞯难?，并被機(jī)體的各器官吸收，其可在器官中作為底物或信號分子調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[29]。本實(shí)驗(yàn)中，蝦青素促進(jìn)主要SCFAs（乙酸、丙酸和丁酸）的產(chǎn)生，進(jìn)而總SCFAs的產(chǎn)生增加，結(jié)果顯示蝦青素可通過SCFAs依賴途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

綜上所述，蝦青素可減少HepG2細(xì)胞中脂滴含量，調(diào)節(jié)高脂膳食飼喂C57BL/6J小鼠血脂水平和糞便中SCFAs的含量、改善肝臟病理狀態(tài)、調(diào)控肝臟中脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)并對血脂代謝起到調(diào)節(jié)作用，推測其具有較好的降血脂生物活性，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。