丁從文，馮 群，李春煥

（1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點實驗室，廣西 百色 533000；2.百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣西 百色 533000）

從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）發(fā)酵液中提取分離的化學(xué)成分及其抗病效果的研究已廣為報道：曹燕魯?shù)萚1]報道B. megateriumB1301菌株可以發(fā)酵產(chǎn)生一類廣譜抗菌蛋白類化學(xué)成分；秦健[2]報道B. megateriumB-196菌株可發(fā)酵產(chǎn)生對水稻紋枯病菌具有抑制活性的脂肽類化合物（IturinA2）；王一然等[3]報道B. megateriumCICC 10055菌株發(fā)酵液中的谷氨酸脫羧酶能加快谷氨酸迅速轉(zhuǎn)化為有降壓利尿功能的4-氨基丁酸；趙妗頤等[4]研究表明B. megateriumL2菌株發(fā)酵液中的2-苯基醋酸甲酯等21 種單體化合物對魔芋軟腐病菌（Erwinia carotovora）具有高效的抗菌能力，也有研究表明B. megateriumL2所產(chǎn)的亞油酸等27 種化合物的復(fù)配物對青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）具有較強的抑菌活性[5]。由此可見，不同來源B. megaterium所產(chǎn)生的抗菌活性成分有所不同，而B. megaterium對采后芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）抗菌活性成分的研究鮮見報道。廣西巖溶地區(qū)土壤缺少營養(yǎng)，并且石漠化異常嚴(yán)重[6]，被稱作特殊環(huán)境[7]。特殊環(huán)境中分離純化獲得的微生物菌株不僅適應(yīng)能力很強，而且其菌株的代謝方式也不同于普通環(huán)境，可以產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)特殊、活性很強的次生代謝產(chǎn)物[8]。

本實驗以廣西獨特的巖溶地區(qū)特殊環(huán)境中分離鑒定的B. megateriumLB01菌株發(fā)酵液為研究對象，并對此菌株發(fā)酵液中的化學(xué)成分進行了提取及抗菌活性成分的追蹤分離，獲得了一個結(jié)構(gòu)特殊的對采后芒果C. gloeosporioides具有高效抗菌活性的化合物001，并進一步對此化合物進行了結(jié)構(gòu)鑒定及抗病作用機理的深入研究。此研究結(jié)果將為研發(fā)防治芒果采后炭疽病的新型微生物藥物先導(dǎo)化合物提供依據(jù)，同時也為降低芒果貯藏、運輸和銷售過程中因炭疽病造成的經(jīng)濟損失[9-10]提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

芒果自廣西巖溶區(qū)百色市凌云縣的實驗果園采收后，立即運送至實驗室，根據(jù)芒果的體積大小進行分類，選擇未受到任何損害或感染的芒果，采用體積分?jǐn)?shù)1%的NaClO溶液表面消毒2 min，利用無菌蒸餾水洗滌并風(fēng)干。

將實驗室中已保存的采后芒果炭疽病菌（C. gloeosporioides）在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃下培養(yǎng)1～2 周，采用含體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80的無菌蒸餾水沖洗培養(yǎng)物收集孢子，借助血細(xì)胞計數(shù)器調(diào)節(jié)至1.0×104個/mL。

B. Megaterium分離自廣西獨特的特殊巖溶環(huán)境并鑒定保存于桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點實驗室中，編號為LB01。

乙酸乙酯、乙醇、石油醚、氯仿、四氫呋喃等濟南恒化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NMReady 60e型核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）儀 加拿大Nanalysis公司；Q Exactive型電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）儀 美國Thermo Fisher公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海汗諾儀器有限公司；OLS4000型激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM） 東莞市昱和儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1B. megateriumLB01發(fā)酵液中抗菌活性成分的追蹤分離及純化

發(fā)酵液的制備[11]：菌株LB01經(jīng)擴大培養(yǎng)后，將獲得的活化菌株倒入LB液體培養(yǎng)基（m（胰蛋白胨）∶m（酵母提取物）∶m（氯化鈉）∶m（瓊膠）∶m（蒸餾水）＝2∶1∶2∶3∶200）中，以180 r/min的轉(zhuǎn)速于搖床上35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)58 h，得到菌株發(fā)酵液。

B. megateriumLB01發(fā)酵液（48 L）通過小孔濾膜進行減壓過濾，收集發(fā)酵濾液，參考文獻(xiàn)[12]的方法，采用大孔樹脂吸附柱富集發(fā)酵液中化學(xué)成分，首先用2 倍柱體積的去離子水洗脫樹脂，除去NaCl、KCl等鹽類以及大極性糖類和雜蛋白，再用洗脫劑乙醇-水、氯仿-甲醇、氯仿-石油醚、乙酸乙酯-石油醚均分別依次采用體積比1∶4、1∶1、4∶1進行梯度洗脫，獲得不同體積的洗脫液，對這些洗脫液分別進行減壓濃縮，將濃縮物溶于無菌蒸餾水中配成質(zhì)量濃度分別為0（對照）、0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0 mg/L的溶液，同時采用紙片擴散（K-B）法[13-14]進行活性追蹤與評價，1 d后根據(jù)抑菌圈直徑判斷各組分的抗菌活性。有活性的組分1和2經(jīng)過薄層色譜、硅膠色譜柱、制備液相色譜及葡聚糖凝膠色譜技術(shù)[15]進一步分離及純化，獲得純品單體001～004。對這4 種單體再次進行活性追蹤檢查，最終篩選到對采后芒果C. gloeosporioides具有顯著抑制活性的單體001，將5 mg單體001溶于20 mL、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液中進行重結(jié)晶，得到高純度的晶體，供抑菌機理研究使用?；钚宰粉櫡蛛x及純化流程如圖1所示。

圖 1 抗菌活性化合物001的追蹤分離及純化流程Fig. 1 Flow chart for the separation and purification of antifungal bioactive compound 001

1.3.2B. megateriumLB01抗菌活性單體001的結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.2.1 抗菌活性單體001的ESI-MS、NMR圖譜測定

ESI-MS圖譜測定：取5 mg純凈單體001，采用體積分?jǐn)?shù)50%四氫呋喃-水溶液配制成10 μg/mL的單體化合物001的溶液，通過注射泵直接進樣，進行正離子檢測，使用氦氣作為碰撞氣，離子源噴射電壓為4.62 kV；毛細(xì)管電壓及溫度分別為6.18 V、179 ℃；鞘氣和輔助氣為氮氣，流速分別為0.78、0.16 L/min；待測單體化合物001的溶液流速為12 μL/min。

1H NMR與13C NMR圖譜測定：取5 mg純凈單體001溶于裝有氘代氯仿（CDCl3）的核磁管中，搖動核磁管直至形成澄清的溶液，進行1H NMR測定，核磁場頻率為400 MHz；另取15 mg純凈單體001分批加入到裝有氘代氯仿（CDCl3）的核磁管中，用同樣的方法形成澄清溶液，進行13C NMR測定，核磁場頻率為100 MHz。

ESI-MS、1H NMR及13C NMR分析：根據(jù)ESI-MS中的準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)荷比（m/z），判斷單體001的相對分子質(zhì)量（relative molecular mass，Mr），通過1H NMR明確單體001中氫原子的個數(shù)，通過13C NMR判斷活性單體001中碳原子的類型或者數(shù)量，結(jié)合13C NMR與1H NMR確定單體001的化學(xué)式，計算其不飽和度，手性單體則需通過測定其旋光度判斷抗菌活性單體的絕對構(gòu)型。

1.3.2.2 抗菌活性單體001的結(jié)構(gòu)鑒定

通過ESI-MS數(shù)據(jù)及1H NMR與13C NMR中碳、氫原子和官能團的信號以及化合物理化性質(zhì)，兼顧數(shù)據(jù)庫中化合物的檢索比對，對抗菌活性單體進行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.3 抗菌活性單體001的抑菌效果分析

1.3.3.1 活體抗菌實驗

參考文獻(xiàn)[16]的方法，采用一枚無菌釘子于芒果果實腰部打一個直徑為4.0 mm、深度為2.5 mm的傷口，然后將其浸在5.0 mg/L的單體001溶液中，以等體積的無菌蒸餾水代替單體溶液作為對照。2 min后取出芒果，于空氣中風(fēng)干2 h后，將C. gloeosporioides孢子懸浮液（1.0×104個/mL）噴霧接種至每個芒果果實的傷口，然后將芒果均貯存在25 ℃環(huán)境中14 d，每隔7 d測定芒果果實的發(fā)病率和病斑直徑，每次處理15 個芒果。

1.3.3.2 離體抗菌實驗

參考文獻(xiàn)[17]，制備0、1、3、5、7 mg/L的單體001溶液，將單體001溶液加到含有熔化的PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，得到終質(zhì)量濃度為0.0（對照）、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L的單體001溶液，混勻后加到滅菌的培養(yǎng)皿（直徑10 cm）中，于培養(yǎng)皿中心接種C. gloeosporioides菌餅，于22～25 ℃溫育，采用游標(biāo)卡尺測定菌落直徑，并依據(jù)公式（1）計算抑菌率。

參考文獻(xiàn)[14]的方法，將100 μLC. gloeosporioides孢子懸浮液（1.0×104個/mL）、1.2 mL PDB培養(yǎng)基和3.0 μL不同質(zhì)量濃度的單體001溶液加到2.5 mL無菌離心管中，使單體001的終質(zhì)量濃度分別為0.0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L。取出150 μL混合液均勻涂在載玻片上，然后將其置于底部鋪有圓形濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于25 ℃下培養(yǎng)8 h，測定各組孢子萌發(fā)率及芽管長度。每個處理中至少測100 個孢子。孢子萌發(fā)率根據(jù)公式（2）計算，芽管長度通過顯微鏡目鏡鏡筒中測微尺進行測量。

1.3.4 抗菌活性單體001對病原菌的作用機理分析

1.3.4.1 活性氧水平、丙二醛含量的測定

根據(jù)Shi Xuequn等[18]的方法，采用氧化劑敏感探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydroflf luorescein diacetate，DCHF-DA）測定C. gloeosporioides孢子細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平。將250 μLC. gloeosporioides孢子懸浮液（1.0×104個/mL）加入到3 mL含有0.0（對照）、5.0 mg/L單體001溶液的PDB培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床中25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，于6、12、18 h取出15 μL混合液于0～4 ℃ 5 000 r/min離心6 min，采用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）洗滌，并在含有10 μmol/L DCHF-DA（溶于二甲基亞砜）的相同緩沖液中避光孵育5 min，再用磷酸鉀緩沖液洗滌2 次后，于熒光顯微鏡下觀察孢子。對氧化劑較為敏感的熒光探針DCHF-DA與孢子內(nèi)產(chǎn)生的ROS作用后會發(fā)生熒光染色；因此，可以通過計算每個處理組中被DCHF-DA染色的孢子細(xì)胞比例，判斷單體001對孢子內(nèi)產(chǎn)生ROS水平的影響。

將C.gloeosporioides的孢子懸浮液（1.0×104個/mL）加入到含有0.1 L液體PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，在搖床上25 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d后收集菌絲體。然后將菌絲體（2 g）置于錐形瓶中，加入0.1 L液體PDB培養(yǎng)基和5.0 mg/L單體001溶液，200 r/min、25 ℃搖床培養(yǎng)0、6、12 h和18 h后，收集菌絲體，根據(jù)Wang Yousheng等[19]的方法測定丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量。以錐形瓶中不添加單體001作為對照。

1.3.4.2 孢子線粒體分布的測定

參考Shi Xuequn等[18]的方法，將200 μ LC. gloeosporioides孢子懸浮液（1.0×104個/mL）加到3 mL含有0.0（對照）、5.0 mg/L單體001溶液的PDB培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床中25 ℃、200 r/min培養(yǎng)，2、6、12 h和18 h后取出20 μL孢子液，加入0.1 μL線粒體選擇性染色劑（Mito Tracker?Orange CMTMRos），對孢子線粒體染色5 min，采用LSCM檢測被線粒體染色劑染色的孢子發(fā)出的熒光，每次處理至少測定20 個孢子，重復(fù)3 次。

1.3.4.3 孢子膜完整性的測定

對比上述實驗結(jié)果，對酶標(biāo)板培養(yǎng)孔孔位為同一顏色采用方案一和方案二進行不同組的實驗結(jié)果來看，方案二計算酶標(biāo)板培養(yǎng)孔的顏色的HSV平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差較方案一出現(xiàn)明顯降低，平均值波動更小，有效降低顏色特征提取的誤差.

參考文獻(xiàn)[20]的方法，將180 μLC. gloeosporioides孢子懸浮液（1.0×104個/mL）分別加到2 mL含有0.0 mg/L（對照）和5 mg/L單體001溶液的PDB培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床中27 ℃、190 r/min振蕩培養(yǎng)，6、12 h和18 h后取出10 μL孢子液于4 ℃離心（5 000 r/min）15 min，采用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，加入10 μmol/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色劑進行染色，通過配有熒光素羅丹明過濾器的顯微鏡觀察染色孢子，采用數(shù)碼相機拍攝染色孢子圖像。每個樣本隨機選取3 個視野，并將亮場中的孢子數(shù)定義為總數(shù)。膜完整性根據(jù)公式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，通過單因素方差分析進行Duncan’s顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌活性單體001的追蹤分離結(jié)果

采用不同比例的洗脫劑進行梯度洗脫，獲得不同體積的洗脫液組分，使用紙片擴散法（K-B法）進行抗菌活性追蹤檢測，對具有活性大小相同或者相似的組分進行合并，分別獲得活性組分1與活性組分2，活性組分1和2再次進行柱層析分離，對具有相同比移值的單體化合物進行合并，共獲得4 種單體001～004。通過紙片擴散法可以觀察到，含有0.5 mg/L單體001～004的紙片對病原菌C. gloeosporioides均不能產(chǎn)生相應(yīng)的抑菌圈，而含有5.0 mg/L單體001～004的紙片對病原菌都可以產(chǎn)生不同直徑的抑菌圈。

表 1 紙片擴散法觀察到的質(zhì)量濃度為5.0 mg/L的單體001～004對炭疽菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters produced by monomers 001 through 004 against C. gloeosporioides in disk diffusion test

活性追蹤結(jié)果如表1所示，編號為002、003、004的單體對炭疽菌的抑菌圈直徑在10 mm左右，顯著低于編號為001的單體抑菌圈直徑（（21.00±1.64）mm），說明單體001對芒果炭疽病菌具有高效的抑制活性?；钚越M分1與活性組分2的抑菌圈直徑分別為（23.19±0.02）、（19.26±0.08）mm。活性組分1通過色譜分離獲得的單體化合物001的抑菌活性小于活性組分1，單體化合物002的抑菌活性十分微弱；活性組分2具有較強的抗菌活性，但經(jīng)分離獲得的單體化合物003與004的抗菌活性卻非常弱。由此可以判斷單體活性成分在分離之前可能存在協(xié)同效應(yīng)，該部分工作有待進一步系統(tǒng)研究。

2.2 抗菌活性活性成分001的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

重結(jié)晶得到的單體001為白色晶體，[α＝-9.50（c 0.68, CHCl3），1H NMR（CDCl3, 400 MHz）δ：5.51（1H, t,J＝10.6Hz, H-3）、5.43（1H, t,J＝10.6 Hz,H-4）、3.47（2H, t,J＝10.9 Hz, H-1）、2.59（2H, d,J＝11.4 Hz, H-11）、2.37（2H, m, H-5）、2.36（1H,m, H-6）、2.34（2H, t,J＝17.5 Hz, H-8）、2.32（2H,m, H-2）、2.30（1H, m, H-10）、2.27（2H, m, H-9）；13C NMR（CDCl3, 100 MHz）δ：221.8（s, C-7）、178.6（s, C-12）、128.4（d, C-4）、128.5（d, C-3）、61.7（t, C-1）、56.2（d, C-6）、41.8（t, C-11）、40.9（d, C-10）、39.7（t, C-8）、32.0（t, C-2）、29.0（t, C-9）、27.5（t, C-5）；ESI-MSm/z[Mr+NH4]+（244）、[2Mr+Na]+（475）、[Mr+Na]+（249）。

單體001的1H NMR（CDCl3, 400 MHz）顯示了2 個具有Z式結(jié)構(gòu)的雙鍵質(zhì)子共振峰，其化學(xué)位移分別為5.51（1H, t,J＝10.6 Hz, H-3）、5.43（1H, t,J＝10.6 Hz, H-4）；1 個與羥基氧直接連接的—CH2上質(zhì)子共振峰的化學(xué)位移是3.47（2H, t,J＝10.9 Hz, H-1），其余5 個—CH2上的質(zhì)子化學(xué)位移分別是2.59（2H, d,J＝11.4 Hz, H-11）、2.37（2H, m, H-5）、2.34（2H, t,J＝17.5 Hz, H-8）、2.32（2H, m, H-2）、2.27（2H, m, H-9），后面5 個—CH2質(zhì)子共振峰的化學(xué)位移顯著低于與羥基氧直接相連—CH2質(zhì)子峰，原因可能在于氧元素具有較大的電負(fù)性，致使與其相連的—CH2質(zhì)子共振峰朝向低場遷移。包括2 種—CH質(zhì)子共振峰，從核磁共振氫譜中共收集到16 種氫，還有2 種氫原子（醇羥基氫與羧基氫）尚未發(fā)現(xiàn)，可能是這2 種氫原子較為活潑或者是使用的溶劑所致。ESI-MSm/z顯示的信號較強且標(biāo)記的3 個準(zhǔn)分子離子峰[Mr+NH4]+、[2Mr+Na]+、[Mr+Na]+的質(zhì)荷比分別為244、475、249，據(jù)此可以計算出化合物001的相對分子質(zhì)量為226。

13C NMR（CDCl3, 100 MHz）中顯示了12 個13C共振信號峰，其中4 個共振信號峰處于低場，它們具有較大的化學(xué)位移，其位移、峰形及位置分別是：221.8（s,C-7）、178.6（s, C-12）、128.4（d, C-4）、128.5（d,C-3），從化學(xué)環(huán)境和峰形可以推斷7位碳是環(huán)戊酮羰基（C＝O）上的碳，12位碳是羧基（COOH）上的碳，4位與3位碳是化合物中的不飽和碳碳雙鍵（C＝C）上的碳；包括其余8 個碳的共振信號峰，共有12 個碳原子，與12-羥基茉莉酸（12-hydroxyjasmonic acid，TA）的碳原子數(shù)一致。結(jié)合單體化合物001的ESI-MS、1H NMR可以推斷化合物001的化學(xué)式是C12H18O4。將該化合物001的ESI-MS、1H NMR和13C NMR的數(shù)據(jù)與原始數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行比照，檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物001與文獻(xiàn)[21]中報道的此化合物高度匹配。根據(jù)以上解析可以判斷化合物001是TA，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖 2 抗菌活性化合物001的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Chemical structure of antifungal compound 001

2.3 TA對采后芒果炭疽病發(fā)病率及發(fā)病程度的影響

與對照組相比較，TA能顯著抑制芒果炭疽病的發(fā)生（圖3A）。接種7 d后，對照組芒果果實已完全腐爛，但經(jīng)TA處理過的芒果果實的炭疽病發(fā)病率僅為46.8%（圖3B）。此外，在接種炭疽病菌7、14 d后，TA處理過的芒果果實中的病斑直徑分別僅為5.67、15 mm，而對照組芒果果實中的病斑直徑分別為28.33、66.00 mm（圖3C）。這些結(jié)果可以充分表明，TA處理能顯著減少芒果果實中炭疽病的發(fā)病率，大大降低芒果炭疽病的發(fā)病程度。

圖 3 TA對芒果炭疽病的抗病效果Fig. 3 Anti-anthracnose disease effect of TA in vivo

2.4 TA對炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

表 2 不同質(zhì)量濃度的TA對芒果炭疽病菌的抑菌率Table 2 Inhibitory rates of TA at different concentrations against C. gloeosporioides

由表2可知，由培養(yǎng)基稀釋的4 種不同質(zhì)量濃度TA均抑制了芒果炭疽病菌的菌絲生長，與對照組相比，0.7 mg/L TA處理組病原菌的生長受到完全抑制，抑菌率高達(dá)100%，此時的菌落直徑僅0.0 mm；而單體TA質(zhì)量濃度為0.1、0.3 mg/L時的抑菌效果較差。

表 3 不同質(zhì)量濃度的TA對炭疽菌孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different TA concentrations on the percentage of spore germination of C. gloeosporioides

由表3可知，不同質(zhì)量濃度的TA可顯著抑制炭疽病菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長（P＜0.05），且隨TA質(zhì)量濃度升高，抑制作用增強，當(dāng)TA質(zhì)量濃度為0.7 mg/L時，炭疽病菌孢子萌發(fā)完全受到抑制，此時芽管長度與C. gloeosporioides孢子直徑接近。

2.5 TA對C. gloeosporioides孢子產(chǎn)生ROS的影響

在25 ℃下，采用單體TA處理6、12、18 h后，可檢測到C. gloeosporioides孢子中的ROS生成情況（圖4）。在培育6、12 h后，對照組中大約有67%、73%的孢子細(xì)胞被DCHF-DA染色，而處理組大約有73%、83%的孢子細(xì)胞被DCHF-DA染色。這些研究結(jié)果表明，單體TA處理能顯著誘導(dǎo)C. gloeosporioides孢子中ROS的產(chǎn)生。

圖 4 TA對炭疽病菌孢子中ROS產(chǎn)生的影響Fig. 4 Effect of TA on the generation of reactive oxygen in spores of C. gloeosporioides

2.6 TA對C. gloeosporioides菌絲體中MDA含量的影響

通過測定C. gloeosporioides菌絲體MDA含量，可以分析單體TA對C. gloeosporioides氧化損傷的影響。與對照組相比，單體TA處理6、12、18 h后，可以觀察到C. gloeosporioides菌絲體中MDA含量較高（圖5）。這說明單體TA加快了C. gloeosporioides的氧化損傷。

圖 5 TA對炭疽病菌菌絲體中MDA含量的影響Fig. 5 Effect of TA on the MDA content of C. gloeosporioides

2.7 TA對C. gloeosporioides孢子中線粒體分布的影響

圖 6 TA對炭疽病菌孢子中線粒體分布的影響Fig. 6 Effect of TA on the distribution of mitochondria in spores of C. gloeosporioides

如圖6所示，培養(yǎng)2、6、12、18 h后，可以觀察到對照組C. gloeosporioides孢子有豐富的線粒體且分布均勻，熒光強度較強；相比之下，線粒體在單體TA處理后的孢子中分布不均且局部聚集化，在用TA處理6、12、18 h后，大多數(shù)孢子內(nèi)熒光十分微弱且線粒體很大程度地變黑，可能是處理組TA直接與孢子線粒體發(fā)生了作用，造成線粒體損壞。

2.8 TA對C. gloeosporioides孢子膜完整性的影響

為了測定在TA作用下C. gloeosporioides的生存力，對TA處理的孢子進行PI染色。在培養(yǎng)6、12 h和18 h后，對照組中孢子細(xì)胞膜完整性依次為98.5%、83.6%和65.7%，而TA處理組的孢子細(xì)胞膜完整性分別為73.4%、68.8%和43.6%（表4）。這些結(jié)果分析表明，TA對C. gloeosporioides孢子細(xì)胞膜有較大程度的損傷作用。

表 4 TA對炭疽菌孢子細(xì)胞膜完整性的影響Table 4 Effect of TA on the cell membrane integrity of C. gloeosporioides spores

3 討 論

本實驗以分離自廣西巖溶區(qū)特殊環(huán)境的巨大芽孢桿菌的發(fā)酵液為原料，以采后芒果炭疽菌為靶標(biāo)菌，采用紙片擴散法進行抗菌活性成分的追蹤，采用色譜法分離出4 種單體化合物（001～004），其中的單體001抑菌活性最顯著，此化合物001經(jīng)質(zhì)譜和核磁鑒定為TA。

近年來，茉莉酸及其衍生物如茉莉酸甲酯、茉莉酸乙酯、茉莉酮、二氫茉莉酸丙酯、TA等在食品工業(yè)上的應(yīng)用備受關(guān)注[22]。許多研究者發(fā)現(xiàn)茉莉酸衍生物可以有效地減少藍(lán)莓乙烯釋放量[23]、降低藍(lán)莓果實腐爛率[23]、增加鮮切菠蘿的抗衰老活性[24]，并且對葡萄炭疽病菌[25]、獼猴桃軟腐病菌[26]和蘋果青霉病菌[27]均具有較強的抑制作用。另外文獻(xiàn)報道茉莉酸衍生物能與人類癌細(xì)胞線粒體作用，致使線粒體發(fā)生腫脹[28]，其中的茉莉酸類化合物TA對臨床上易被腫瘤患者感染的銅綠假單胞菌具有良好的抑制作用[29]，同時其在熱帶地區(qū)的風(fēng)味食品中常被用作調(diào)味劑[22]。因此推測具有抗菌效果的茉莉酸及其衍生物可以在食品微生物病害防治上安全使用。

然而截至目前為止，茉莉酸衍生物TA對采后芒果炭疽病菌抑制作用及其作用機理的相關(guān)信息有限。本實驗發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌LB01產(chǎn)生的抗菌活性成分TA對采后芒果炭疽病害具有很好的控病效果，并對其抗病機理進行了初步探討。

與對照組相比，5 mg/L TA對芒果采后炭疽病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度均有顯著影響（圖3），表明TA對采后芒果果實炭疽病具有較強的抗病效果。此外，經(jīng)TA處理后，病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)率也顯著降低，同時隨著TA質(zhì)量濃度的增加，抑制作用也增強（表2、3）。

ROS可能對細(xì)胞中化合物造成氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至細(xì)胞死亡[30-31]。在所有細(xì)胞中，ROS的產(chǎn)生和清除在細(xì)胞內(nèi)保持平衡。氧化還原動態(tài)平衡要求不同細(xì)胞間的有效協(xié)調(diào)，并受復(fù)雜的信號傳導(dǎo)路徑控制[32]。細(xì)胞內(nèi)存在一系列抗氧化劑，其可以清除ROS，保護自身免受氧化損傷。本研究結(jié)果表明，用5.0 mg/L TA處理的芒果炭疽菌顯示出更高的MDA含量（圖5）。此外，用一種氧化劑敏感探針DCHF-DA研究了芒果炭疽菌孢子中ROS的積累，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5.0 mg/L TA處理的孢子染色細(xì)胞比例高于對照組（圖4）。這些結(jié)果表明，化合物TA能誘導(dǎo)炭疽菌的孢子中ROS的積累及菌絲體內(nèi)MDA含量的升高，從而抑制孢子萌發(fā)和菌絲體生長，這可能是化合物TA防治采后芒果炭疽病、抑制采后芒果炭疽病菌生長的機制之一。

線粒體是細(xì)胞ATP的主要產(chǎn)生部位，在多種細(xì)胞過程中起著核心作用[33-34]，此外，線粒體呼吸活動也是ROS的主要內(nèi)生源，其積累可導(dǎo)致生物大分子氧化，導(dǎo)致mtDNA突變、衰老和細(xì)胞凋亡[35-36]。在本研究中，還發(fā)現(xiàn)線粒體在化合物TA處理后的孢子中發(fā)生異常分布和較大程度的損壞（圖6），表明化合物TA處理可引起C. gloeosporioides孢子線粒體損傷。病原菌孢子的ROS積累和線粒體損壞可能是化合物TA抑制C. gloeosporioides生長的重要方式之一，從而抑制采后芒果果實炭疽病的發(fā)生。

5.0 mg/L TA處理接種了C. gloeosporioides孢子懸浮液的芒果7 d和14 d后，芒果果實仍呈黃色，但對照組芒果果實已變?yōu)槌壬▓D3A），表明TA在芒果采后衰老控制中的起重要作用。芒果是一種對乙烯敏感的水果，在衰老過程中呼吸作用與乙烯產(chǎn)生量顯著增加[37]，乙烯在植物種子萌發(fā)、植物生長、果實成熟、器官脫落和衰老以及抗病性等生理過程中起著重要作用[38]。本實驗中，經(jīng)活性篩選到的化合物TA可能抑制了芒果中乙烯的產(chǎn)生或阻止乙烯與炭疽菌受體的結(jié)合，減少了芒果腐爛，使芒果果實炭疽病的癥狀大大降低。而對照組芒果體內(nèi)乙烯自由釋放以致芒果后熟與衰老加快。因此，延緩芒果果實衰老也可能是化合物TA抑制采后芒果炭疽病害的機制之一。

綜上，本研究從特殊環(huán)境巨大芽孢桿菌發(fā)酵液中分離的抗菌活性單體001，經(jīng)質(zhì)譜和核磁等波譜解析，鑒定其為TA，并證明其可通過直接抑制芒果炭疽菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，從而抑制芒果采后炭疽病的發(fā)生。本研究結(jié)果為TA對炭疽菌的抑制作用機制提供了一個框架，為芒果采后病害防治提供了一種有前景的策略。至于抗菌活性成分TA是通過何種方式作用于病原菌，還有待于進一步深入研究。