曹學(xué)全 阮正英 魏科娜 盧洪勝 蔡小波 戴岳楚 周璐青 顧華敏

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的80%，大多數(shù)患者預(yù)后良好[1]。然而，10%～15%的PTC表現(xiàn)有侵襲性，容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致患者死亡。因此，闡明PTC的分子機(jī)制可能有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)[2-3]。前B細(xì)胞白血病同源盒基因3（pre-B-cell leukemia homeobox gene 3，PBX3）是PBX家族的一個(gè)含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在四肢、心臟等早期發(fā)育和細(xì)胞周期調(diào)控、維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)等過(guò)程中具有廣泛的作用[4]。進(jìn)一步研究表明，PBX3在胃癌[5]、肝細(xì)胞癌[6]和多發(fā)性骨髓瘤[7]等多種惡性腫瘤中存在過(guò)表達(dá)，且上調(diào)PBX3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞周期進(jìn)展等惡性生物學(xué)行為。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）通過(guò)去磷酸化磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸（PIP3）負(fù)性調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B（PI3K/Akt）信號(hào)通路[8]，是一種重要的抑癌基因，在抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[9]。PTC中PBX3和PTEN表達(dá)是否存在相關(guān)性及PBX3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚。本研究采用免疫組化En Vision二步法檢測(cè)PTC組織和癌旁正常甲狀腺組織中PBX3和PTEN的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的特點(diǎn)及相關(guān)性，探討PBX3和PTEN表達(dá)改變與PTC發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年1月至2018年1月在臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院）住院行手術(shù)切除和石蠟包埋的PTC標(biāo)本80例，術(shù)后常規(guī)病理診斷結(jié)果為PTC。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物學(xué)治療。80例PTC患者中，男26例，女54例；年齡21～77（45.37±12.04）歲，其中＜55歲 59例，≥55歲 21例；腫瘤直徑≤2 cm 56例，＞2 cm 24例；伴有包膜侵犯28例，無(wú)包膜侵犯52例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；參照2018年第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)（UICC）制定的甲狀腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期68例，Ⅲ～Ⅳ期12例。并選取癌旁正常甲狀腺組織（距離腫瘤≥2 cm）30例作為對(duì)照，經(jīng)病理診斷均為正常甲狀腺組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑 PBX3兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，PTEN鼠抗人單克隆抗體、En Vision通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 PTC組織和癌旁組織中PBX3和PTEN蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化En Vision二步法。制作4 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓水浴抗原修復(fù)，1%山羊血清封閉，滴加一抗（PBX3稀釋濃度為 1∶200，PTEN 為 1∶100）4 ℃冰箱過(guò)夜，第 2天滴加二抗（EnVision免疫組化檢測(cè)試劑），DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明和樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀(guān)察PBX3和PTEN蛋白表達(dá)特點(diǎn)和陽(yáng)性定位。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，PBX3用前列腺癌組織作陽(yáng)性對(duì)照，PTEN用乳腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為淡黃色至棕褐色顆粒，PBX3陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，PTEN陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取至少5個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分和記錄。每張切片根據(jù)半定量積分法進(jìn)行判定，最終積分=染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積。染色強(qiáng)度：無(wú)顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%～50%為 2分，＞50%～75%為 3分，＞75%為4分。最終積分＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，PBX3和PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織和癌旁組織中 PBX3、PTEN的表達(dá)PTC組織中PBX3陽(yáng)性表達(dá)率為73.75%（59/80），高于癌旁組織的16.67%（5/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.220，P＜0.05）；PTC 組織中 PTEN 陽(yáng)性表達(dá)率為35.00%（28/80），低于癌旁組織的 83.33%（25/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.415，P＜0.05），見(jiàn)圖 1（插頁(yè)）。

2.2 PTC組織中PBX3、PTEN陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PBX3陽(yáng)性表達(dá)率分別高于無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而不同性別、年齡和腫瘤直徑PTC組織中PBX3陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率分別低于無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而不同性別、年齡和腫瘤直徑PTC組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 PTC組織中PBX3、PTEN陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 PTC組織中 PBX3、PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示PTC組織中PBX3、PTEN蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.337，P＜0.05），見(jiàn)表 2。

3 討論

PBX3是PBX家族中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的同源結(jié)構(gòu)域，通過(guò)與其他同源蛋白相互作用及序列5′-ATCAATCA-3′結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活或靶基因沉默[9-10]。近年研究顯示，PBX3在一些實(shí)體腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的作用及分子機(jī)制已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，在核仁磷酸蛋白1（nucle－ophosmin1，NPM1）突變的急性髓系白血病中，PBX3受同源框蛋白 A9（homeobox protein A9，HOXA9）的調(diào)控，特別是當(dāng)HOXA9上調(diào)或下調(diào)時(shí)，PBX3的表達(dá)增加或減少。盡管HOXA9的表達(dá)不受PBX3的限制，但PBX3或HOXA9的丟失都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，表明上調(diào)PBX3和HOXA9表達(dá)對(duì)NPM1突變細(xì)胞的存活至關(guān)重要[11]。生存分析顯示，高表達(dá)的HOXA9或PBX3與胃癌的低生存率相關(guān)，Cox回歸模型的多因素分析顯示PBX3表達(dá)是胃癌獨(dú)立的預(yù)后因素[12]。表明PBX3和其他同源蛋白通過(guò)調(diào)控作用在血液腫瘤及實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞系及組織中PBX3表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與腫瘤直徑、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、血管浸潤(rùn)和臨床分期有關(guān)。PBX3可以通過(guò)Akt信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，并且可以作為預(yù)后的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中PBX3陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，提示PBX3表達(dá)上調(diào)可能與PTC濾泡上皮癌變的發(fā)生有關(guān)。包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PBX3陽(yáng)性表達(dá)率分別高于無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PBX3過(guò)表達(dá)與PTC的包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高的臨床分期密切相關(guān)。而PBX3表達(dá)與PTC的直徑無(wú)關(guān)，與Li等[13]在宮頸癌中的研究結(jié)果不一致，可能與不同的腫瘤類(lèi)型或樣本量少有關(guān)。

表2 PTC組織中PBX3、PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性（例）

PTEN是第一個(gè)報(bào)道的具有磷酸酶活性的抑癌基因，是繼p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因之后與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的抑癌基因，它通過(guò)阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-15]。PTEN丟失可引起Akt介導(dǎo)的磷酸化和NF-κB活性增加，從而促進(jìn)p53降解。p53降解降低了細(xì)胞凋亡能力并誘導(dǎo)了細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。Windarti等[16]對(duì)7項(xiàng)研究進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，然后通過(guò)Meta分析評(píng)估PTEN丟失與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)PTEN丟失與乳腺癌預(yù)后不良之間存在相關(guān)性，并且納入的研究沒(méi)有明顯的偏倚。該研究證實(shí)PTEN丟失是乳腺癌重要的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究顯示，PTC組織中PTEN陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，且包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期的PTC組織中PBX3陽(yáng)性表達(dá)率分別低于無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ期的PTC組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PTEN表達(dá)缺失或低表達(dá)在PTC發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起促進(jìn)作用，采用免疫組化檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)特點(diǎn)可用于判斷PTC的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

PBX3和PTEN在PTC中的關(guān)系如何，目前尚不清楚。本研究采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析從蛋白水平探討PTC中PBX3和PTEN表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PBX3高表達(dá)，而PTEN低表達(dá)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且與PTC的包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。綜合以上研究結(jié)果，PBX3和PTEN異常表達(dá)可能在PTC發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起負(fù)向調(diào)控作用，兩者有望成為PTC診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療的生物學(xué)指標(biāo)。