吳林珍 魯建央 孫亞青 胡志英

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡的第2位[1]，在我國，更是居女性惡性腫瘤死亡的首位[2-3]。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的分子調(diào)控機(jī)制的研究不斷深入，針對(duì)惡性腫瘤的分子靶向治療已經(jīng)成為現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。索拉非尼作為一種多靶點(diǎn)激酶抑制劑，已被用于多種惡性腫瘤的治療；貝伐單抗作為單靶點(diǎn)藥物也已被應(yīng)用于肺癌等的一線治療方案。本實(shí)驗(yàn)通過建立615小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14移植瘤動(dòng)物模型，聯(lián)合使用索拉非尼和貝伐單抗后觀察宿主瘤體變化，檢測(cè)移植瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和 B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，Bax）基因的表達(dá)，探討兩藥協(xié)同抗腫瘤的作用，旨在為這種新型生物化療模式的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和儀器 宮頸癌細(xì)胞株U14（中國醫(yī)學(xué)院科學(xué)院）；615小鼠（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）；索拉菲尼片（德國拜耳公司，規(guī)格：0.2 g/片，批號(hào)：H20110599）；貝伐單抗注射液（上海自羅氏制藥有限公司，規(guī)格：100 mg/支，濃度 25 mg/ml，批號(hào)：S20100068）；生物安全柜（美國 Thermo公司，1300A2）；均質(zhì)機(jī)（法國Bertin公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；ABI StepOnePlus PCR儀（美國Bio-Rad公司）；超低溫冰箱（美國Thermo公司）；微量核酸測(cè)定儀（美國 Thermo公司，nanodrop）；PCR儀（美國 Bio-Rad公司）；制冰機(jī)（日本Panasonic公司，SIM-F140AY65-PC）；移液器（德國 Eppendorf公司，Research）；RNA 提取試劑盒（日本TaKaRa公司，AHF1991D）；RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司，RR036A）；SYBR Green熒光定量PCR染料（日本TaKaRa公司，AK9301）。本實(shí)驗(yàn)依托浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 小鼠荷瘤模型的制備

1.2.1 小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14復(fù)蘇 從液氮保存罐中取出裝有宮頸癌細(xì)胞株U14的凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。將細(xì)胞懸液移入離心管，緩慢放入4 ml RPMI1640培養(yǎng)液，離心，棄上清液，用RPMI1640培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為7.5×107/ml，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)復(fù)蘇的細(xì)胞活性，放置培養(yǎng)箱中備用。

1.2.2 小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14傳代 宮頸癌細(xì)胞株U14復(fù)蘇后，于無菌條件下按每只615小鼠腹腔內(nèi)注射0.2 ml約1.5×107個(gè)活細(xì)胞。待7～10 d后，在無菌條件下抽取腹水用于傳代或荷瘤。

1.2.3 移植成瘤 將上述抽取的腹水，用0.9%氯化鈉溶液稀釋后取樣用臺(tái)盼藍(lán)染色鏡檢，證實(shí)為成活瘤細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/ml。隨即依次在615小鼠右側(cè)腋下于腋中線上約 2 cm處皮下接種0.2 ml約1×107個(gè)活細(xì)胞。每日觀察小鼠及其局部成瘤情況，腫瘤直徑≥5 mm時(shí)為成瘤。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只已成瘤小鼠分為空白對(duì)照組、索拉非尼組、貝伐單抗組和聯(lián)合用藥組4組，每組10只。索拉非尼組給予索拉非尼溶液4.5 ml/kg（索拉菲尼片200 mg/片溶解于30 ml 0.9%氯化鈉溶液，濃度調(diào)整至6.67 mg/ml），經(jīng)小鼠胃管灌入，1次/d，共28 d；貝伐單抗組給予貝伐單抗10 ml/kg（貝伐單抗液濃度稀釋至0.5 mg/ml），小鼠左側(cè)腋部皮下注射，1次/d，連用28 d；聯(lián)合用藥組兩藥的劑量及用法分別同單藥組；空白對(duì)照組不做任何處理。

1.4 移植瘤體積和重量測(cè)定 用藥結(jié)束后第3天脫臼法處死小鼠，剝離瘤體，測(cè)量移植瘤體積（cm3），并用天平秤稱重量（g）。

1.5 4組腫瘤細(xì)胞VEGF和Bax mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用RT-PCR法。先進(jìn)行組織的裂解：剪取瘤體組織到均質(zhì)管中，加入 350 μl裂解 Buffer RL（已加入 50×DTT Solution），均質(zhì)機(jī)上破碎裂解。分別收集4組腫瘤細(xì)胞，總RNA提取操作按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書進(jìn)行。再將提取的RNA置于RT反應(yīng)液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為37℃ 15 min，85℃5 s，獲得cDNA保存于-20°C冰箱備用。選用生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)并合成的RT-PCR引物序列，PCR反應(yīng)操作按照TaKaRa熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）進(jìn)行，將獲得的cDNA用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95°C 3 min；40個(gè)循環(huán)（95°C 10 s，60 °C 30 s）；溶解曲線：從 55 °C 開始，每 30 s升高0.5°C，直到95°C，循環(huán)1次。所有反應(yīng)信息資料由ABI StepOnePlus PCR儀收集，Ct值通過計(jì)算機(jī)軟件來測(cè)量和計(jì)算，轉(zhuǎn)錄水平通過公式2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)小鼠移植瘤生長的影響 索拉菲尼組、貝伐單抗組移植瘤體積及重量均低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；索拉菲尼組、貝伐單抗組、空白對(duì)照組移植瘤體積及重量均高于聯(lián)合用藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 藥物對(duì)小鼠移植瘤生長的影響

2.2 4組腫瘤細(xì)胞VEGF和Bax mRNA表達(dá)水平比較索拉菲尼組、貝伐單抗組、聯(lián)合用藥組VEGF mRNA表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；聯(lián)合用藥組VEGF mRNA表達(dá)水平均低于索拉菲尼組、貝伐單抗組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。聯(lián)合用藥組Bax mRNA表達(dá)水平均高于索拉菲尼組、貝伐單抗組、空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 3、圖 1-2（插頁）。

表3 4組腫瘤細(xì)胞VEGF和Bax mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

子宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命；子宮頸癌患病率居高不下，并有年輕化的趨勢(shì)，目前發(fā)病率僅次于乳腺癌，已成為臨床研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[4]。目前，手術(shù)和放化療是子宮頸癌的主要治療手段。對(duì)于早期患者，手術(shù)治療是較為有效的治療方法；對(duì)于中、晚期宮頸癌患者，常常因?yàn)槭ナ中g(shù)機(jī)會(huì)，進(jìn)而只能采用放化療治療手段。但是傳統(tǒng)化療藥物，無論是細(xì)胞周期特異性還是非特異性藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也殺傷大量的非腫瘤性正常細(xì)胞，從而產(chǎn)生一系列毒副反應(yīng)；放療則會(huì)產(chǎn)生一系列合并癥，包括放射線腸炎、放射線膀胱炎及陰道局部攣縮影響性生活等不良反應(yīng)。因此尋找子宮頸癌更為有效的治療措施是非常必要的。具有生物靶向特性的藥物，在提高療效的同時(shí)減少毒副反應(yīng)，是近年來國內(nèi)外研究治療子宮頸癌尤其是中晚期子宮頸癌、復(fù)發(fā)性宮頸癌的熱點(diǎn)。

血管生成通常發(fā)生在發(fā)育或傷口愈合期間，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤時(shí)，血管系統(tǒng)可以通過向腫瘤細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[5]。VEGF在腫瘤血管生成中起著非常重要的作用,它能夠直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、分化、增生,與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[6-7]。國內(nèi)外研究表明宮頸癌組織VEGF表達(dá)與淋巴管轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，新生淋巴管在腫瘤生長中提供腫瘤生長所需要的營養(yǎng)，加深腫瘤細(xì)胞的生物異質(zhì)性[8-9]。由于VEGF的水平與血管形成及腫瘤生長密切相關(guān)，故VEGF可作為腫瘤患者的一個(gè)預(yù)后參考指標(biāo)，并指導(dǎo)和監(jiān)測(cè)臨床療效；同時(shí)也為應(yīng)用血管生長抑制劑進(jìn)行阻斷性治療腫瘤提供理論依據(jù)[10]。

索拉非尼在其化學(xué)特性上可以有力地抑制迅速加速纖維肉瘤（Raf-1）原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶，并且有較強(qiáng)的激酶選擇特性，在體外索拉非尼還表現(xiàn)出對(duì)野生型及V599E突變B-Raf活性的抑制作用[11]。于此同時(shí)，在新生血管形成及腫瘤進(jìn)展中，索拉非尼對(duì)多種酪氨酸激酶受體有明顯抑制作用，包括血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）-2、VEGFR-3、血小板衍化生長因子受體、Fms樣酪氨酸激酶3（Flt-3）等。此外，索拉非尼抑制細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期素依賴激酶4（cdk4）、細(xì)胞周期素依賴激酶 6（cdk6）[12]，使增殖期細(xì)胞不能通過“G1-S”調(diào)節(jié)點(diǎn)，阻滯增殖期細(xì)胞在G1期從而阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而影響細(xì)胞生長促進(jìn)凋亡[13]。正因?yàn)檫@些作用，索拉菲尼已被FDA批準(zhǔn)用于肝癌及腎癌的臨床治療。本研究結(jié)果證實(shí)索拉菲尼對(duì)小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14移植瘤的VEGF有下調(diào)作用。

與索拉非尼具有潛在廣譜的抗腫瘤作用相比，貝伐單抗，即重組人抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體,作為單靶點(diǎn)藥物，特異性高，可與人類各種VEGF高親和性結(jié)合，阻滯VEGF與受體結(jié)合，進(jìn)而阻斷VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙、存活，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞通透性以及一氧化氮、組織因子的產(chǎn)生，抑制腫瘤血管生成[14]，從而有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長和腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證實(shí)貝伐單抗對(duì)小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14移植瘤的VEGF有下調(diào)作用。

細(xì)胞凋亡屬細(xì)胞主動(dòng)性死亡，其對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)防都有非常重要的意義[15]，Bax可發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用。本研究結(jié)果提示索拉菲尼聯(lián)合貝伐單抗對(duì)小鼠宮頸癌細(xì)胞株U14移植瘤的Bax基因有上調(diào)作用，從而促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡。

由于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟作用的結(jié)果，因此作用于單靶點(diǎn)的藥物常常難以明顯起效，即使單靶點(diǎn)藥物對(duì)某一種酶或者受體具有較強(qiáng)的抑制作用，也不一定能夠真正地起到治療疾病的作用；多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物的結(jié)構(gòu)中含有作用于多個(gè)靶點(diǎn)的藥效基團(tuán)，與腫瘤相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生作用從而產(chǎn)生多種藥理活性，進(jìn)而達(dá)到提高療效和改善安全性的目的[16]。故本課題利用多靶點(diǎn)藥物的高靈敏性與單靶點(diǎn)藥物的特異性相結(jié)合，通過聯(lián)合用藥彌補(bǔ)彼此間的不足，在多個(gè)環(huán)節(jié)上阻斷，從而達(dá)到理想的治療效果，本研究結(jié)果提示索拉菲尼聯(lián)合貝伐單抗聯(lián)合用藥對(duì)小鼠宮頸癌細(xì)胞U14移植瘤具有協(xié)同抑制作用。