劉倩菁 劉祖秋 田穎 代小蘭

腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類生命健康的三大疾病之一，具有較高的致殘率和致死率，其中缺血性腦損傷約占60%～80%[1]。腦組織供血不足所致活性氧自由基和炎癥細胞因子大量生成導(dǎo)致血腦屏障通透性異常升高，進而引發(fā)血管源性腦水腫，是缺血性腦損傷致殘、致死的主要原因[2-4]。因此，保護血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整對減輕缺血性腦損傷具有重要意義。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是中藥白芍的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑制細胞凋亡等多種藥理學(xué)作用[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TGP通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對缺血性腦損傷大鼠中樞海馬起到保護作用[7-8]，但TGP對缺血性腦損傷后血腦屏障是否具有保護作用尚不清楚。本實驗擬探討TGP預(yù)處理對缺血性腦損傷大鼠血腦屏障的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康成年雄性SD大鼠180只，體重（240±20）g，購自寧波大學(xué)實驗動物中心[SYXK（浙）2019-0005]。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周[光照：黑暗12 h∶12 h，溫度（25±1）℃，自由飲水進食]后開展實驗。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平（nimodipine，NMP）10 mg/（kg·d）預(yù)處理組和TGP 50、100、200 mg/（kg·d）預(yù)處理組，每組30只。

1.2 主要藥物、試劑與儀器 TGP膠囊（寧波立華制藥有限公司，規(guī)格 0.3 g/粒，批號：201901005）；NMP 膠囊（浙江海力生制藥有限公司，規(guī)格：20 mg/粒，批號：20190318）；伊文思藍（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：W20190129）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒和 TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20190317、20190128、20190402、20181229、20190130）；兔抗鼠腦組織閉合蛋白（Occludin）、閉鎖連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2、MMP-9、β-actin單克隆抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：201905016、201903031、201904012、201903027、201905023）；MR-96A 型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；SZ-1型組織勻漿器（江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠）；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；RM2125型石蠟切片機（德國Leica公司）；BH-2型倒置光學(xué)顯微鏡及攝像（日本Olympus公司）；Allegra 21R型低溫離心機（美國Beckman公司）。

1.3 預(yù)處理給藥 取TGP膠囊內(nèi)容物并精確稱量后，加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度為10、20、40 mg/ml的TGP溶液；取NMP膠囊內(nèi)容物精確稱量，加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度為2 mg/ml的NMP溶液。TGP 50、100、200 mg/（kg·d）預(yù)處理組于造模手術(shù)前7 d開始給予濃度為 10、20、40 mg/ml的 TGP 溶液（5 ml/kg）灌胃，NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組給予2 mg/ml的NMP溶液（5 ml/kg）灌胃，假手術(shù)組和模型組分別給予0.9%氯化鈉溶液（5 ml/kg），均 1次/d。

1.4 缺血性腦損傷大鼠模型的制備 參照李振宗等[9]的報道，采用阻斷大腦中動脈的方法制備缺血性腦損傷大鼠模型：術(shù)前12 h禁食禁水，麻醉后仰位固定、沿頸部正中切口，鈍性剝離右側(cè)頸總動脈至頸外、頸內(nèi)動脈分叉處，然后動脈夾夾閉頸總動脈、結(jié)扎頸外動脈，于頸外動脈殘端切口、插栓線（直徑0.235 mm，頭部灼燒呈釘子帽狀）入頸內(nèi)動脈，遇阻力止，深度距分叉處約18 mm，固定線栓、松開動脈夾后逐層縫合皮膚并消毒處理；假手術(shù)組除不切口和插入線栓外，其余同模型組。造模術(shù)后24 h行各指標(biāo)檢測。

1.5 血腦屏障通透性檢測 采用伊文思藍滲透法。每組大鼠各隨機取10只，以4 ml/kg劑量尾靜脈注射2%伊文思藍溶液，1 h后麻醉、開胸暴露心臟、由左心室-右心耳通路快速灌注300 ml 0.9%氯化鈉溶液、斷頭取腦，稱量右半腦重量后研磨勻漿，加3倍量50%的甲酰胺溶液，恒溫60℃孵育24 h后3 000 r/min離心15 min，取上清液。酶標(biāo)儀測定610 nm波長處吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定伊文思藍含量，腦組織伊文思藍含量可反映血腦屏障通透性。

1.6 腦組織含水量檢測 采用干濕比重法。每組大鼠各隨機取10只，麻醉后迅速斷頭剝?nèi)∧X組織，切取右側(cè)大腦稱重為濕重（W1），恒溫110℃烘烤24 h至恒重后為干重（W2），腦組織含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

1.7 腦組織生化指標(biāo)檢測 取每組剩余的10只大鼠，麻醉后迅速斷頭剝?nèi)∧X組織、切取右側(cè)大腦，剪碎后加入9倍量4℃預(yù)冷的裂解液、研磨勻漿制備腦組織勻漿液。

1.7.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 腦組織勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，高錳酸鉀滴定法測定CAT活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.7.2 炎癥細胞因子檢測 腦組織勻漿液經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清液，按照各ELISA試劑盒操作說明依照步驟處理，通過酶標(biāo)儀測定炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β 含量。

1.7.3 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。腦組織勻漿液經(jīng)恒低溫4℃12 000 r/min離心15 min后取上清液，提取總蛋白并采用二奎磷甲酸法（BCA）測定總蛋白含量，然后通過凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、經(jīng)5%脫脂奶粉37℃封閉1 h后，滴加兔抗鼠 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9、βactin一抗后，4℃恒溫孵育12 h后PBS溶液洗膜，滴加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h后PBS洗膜，滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色；然后以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量目標(biāo)蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性檢測結(jié)果比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織伊文思藍含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示缺血性腦損傷大鼠血腦屏障通透性明顯升高；經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織伊文思藍含量升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），且TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組大鼠腦組織伊文思藍含量低于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組（P＜0.05），提示TGP預(yù)處理具有保護缺血性腦損傷大鼠血腦屏障通透性的作用，見表1。

表1 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性檢測結(jié)果比較

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織含水量升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組大鼠腦組織含水量低于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組（P＜0.05），提示TGP預(yù)處理具有抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織水腫的作用，見表2。

表2 各組大鼠腦組織含水量比較

2.3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD、CAT活性均降低，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織SOD、CAT活性的降低及MDA含量的升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組SOD活性較NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組升高且MDA含量較NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組降低（均P＜0.05），但兩組大鼠CAT活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠腦組織炎癥細胞因子含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β含量均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.01）；經(jīng) TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織TNF-α、IL-1β含量的升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組大鼠腦組織TNF-α含量低于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組（P＜0.05），但兩組大鼠IL-1β含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見表 4。

2.5 各組大鼠腦組織 Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP－9蛋白表達水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Occludin、ZO-1蛋白表達下調(diào)而MMP-2、MMP-9蛋白表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；經(jīng)TGP 50、100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織Occludin蛋白表達的下調(diào)和MMP－9蛋白表達的上調(diào)，經(jīng)TGP 100、200 mg/（kg·d）或NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理7 d則能夠明顯抑制ZO-1蛋白表達的下調(diào)和MMP－2蛋白表達的上調(diào)，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組Occludin、ZO-1蛋白表達較NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組上調(diào)而MMP－2表達下調(diào)（均P＜0.05），兩組大鼠MMP－9蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1-2和表5。

表4 各組大鼠腦組織炎癥細胞因子含量比較

3 討論

血腦屏障能夠阻止某些有害物質(zhì)由血液進入腦組織，對保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。缺血性腦損傷早期即可出現(xiàn)血腦屏障破壞而引發(fā)血管源性腦水腫，是導(dǎo)致腦損傷疾病進展的關(guān)鍵性病理變化。因此，保護血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整對改善缺血性腦損傷預(yù)后具有重要意義。

白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，是我國傳統(tǒng)中藥品種，醫(yī)學(xué)典籍《本經(jīng)》中記載白芍具有“除血痹、破堅積、治寒熱疝瘕、益氣”之功效，《別錄》記載白芍具有“通順血脈、緩中、散惡血、逐賊血”之功效。TGP為中藥白芍的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TGP具有良好的抗氧化、抗炎等生物學(xué)活性。本實驗采用線栓法阻塞大腦中動脈制備缺血性腦損傷大鼠模型，并于造模前7 d開始1次/d灌胃給予TGP進行預(yù)處理，并以臨床治療缺血性腦損傷一線用藥NMP為陽性對照藥物，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGP預(yù)處理能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠腦組織伊文思藍含量滲透量和含水量的升高，并且給予TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理效果優(yōu)于NMP 10 mg/（kg·d）預(yù)處理組，提示TGP預(yù)處理具有保護缺血性腦損傷大鼠血腦屏障通透性并抑制腦組織水腫的作用。

圖1 各組大鼠腦組織閉合蛋白（Occludin）、閉鎖連接蛋白-1（ZO-1）蛋白表達的電泳圖[A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平（NMP）10 mg/（kg·d）預(yù)處理組；D：白芍總苷（TGP）50 mg/（kg·d）預(yù)處理組；E：TGP 100 mg/（kg·d）預(yù)處理組；F：TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組]

圖2 各組大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9蛋白表達的電泳圖[A：假手術(shù)組；B：模型組；C：尼莫地平（NMP）10 mg/（kg·d）預(yù)處理組；D：白芍總苷（TGP）50 mg/（kg·d）預(yù)處理組；E：TGP 100 mg/（kg·d）預(yù)處理組；F：TGP 200 mg/（kg·d）預(yù)處理組]

表5 各組大鼠腦組織Occludin、ZO-1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較

血腦屏障是內(nèi)皮細胞依靠緊密連接蛋白復(fù)合體（tight junction protein systerm，TJPs）連接構(gòu)成的三維網(wǎng)狀超微結(jié)構(gòu)[10]；TJPs主要由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、細胞骨架蛋白等相互作用形成。其中跨膜蛋白Occludin和胞質(zhì)附著蛋白ZO-1是構(gòu)成TJPs的主要成分，兩者相互作用組成TJPs的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。此外，Occludin能夠封閉內(nèi)皮細胞之間的間隙，Occludin缺失將導(dǎo)致TJPs細胞突起減少和骨架破壞，所以O(shè)ccludin對維持血腦屏障結(jié)構(gòu)完整具有至關(guān)重要的作用。ZO-1對細胞極性、胞旁屏障、TJPs骨架形成等具有重要作用，ZO-1缺失將直接影響TJPs生成，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞間縫隙增大而使血腦屏障通透性升高[11]。MMP是連接蛋白降解酶系統(tǒng)的重要組成部分，其中MMP-2、MMP-9能夠消化降解Occludin蛋白并可消化降解內(nèi)皮細胞基底層，從而破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)[12]。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在血腦屏障損傷病理進展過程中發(fā)揮著重要作用。腦組織供血、供氧不足將導(dǎo)致線粒體呼吸鏈?zhǔn)茏瓒纱罅康腞OS，以ROS為底物的抗氧化酶SOD、CAT過度消耗而不能支撐ROS正常清除，導(dǎo)致ROS代謝失衡而過剩，攻擊核酸、蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA[13]。此外，ROS還將攻擊細胞膜而破壞細胞骨架，降解Occludin、ZO-1蛋白而破壞TJPs基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，從而破壞血腦屏障完整性[14]。

缺血性腦損傷發(fā)生后將病理性刺激炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β大量釋放，兩者是觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的趨化因子，在血腦屏障病理過程中具有重要作用。周喜燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β能夠直接破壞TJPs結(jié)構(gòu)，并可通過激活NF-κB而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞黏附分子上調(diào)表達，并與內(nèi)皮細胞黏附而增加血腦屏障通透性。

本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠發(fā)生缺血性腦損傷后腦組織SOD、CAT活性降低而MDA含量升高，炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β含量升高，與張思然等[16]的研究報道一致；發(fā)現(xiàn)Occludin蛋白表達下調(diào)且MMP-2、MMP-9蛋白表達上調(diào)，與王少朋等[17]的研究報道一致。經(jīng)TGP預(yù)處理則能夠有效抑制缺血性腦損傷大鼠SOD、CAT活性降低和MDA含量升高，抑制TNF-α、IL-1β含量升高，抑制Occludin、ZO-1蛋白表達下調(diào)和MMP-2、MMP-9蛋白表達上調(diào)；提示TGP對缺血性腦損傷大鼠血腦屏障的保護作用可能與抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及抑制Occludin、ZO-1蛋白表達下調(diào)和MMP-2、MMP-9蛋白表達上調(diào)有關(guān)。