李 憶

(1.四川民族學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 四川 康定 626001； 2.川藏滇青林草撫育和利用研究中心, 四川 康定 626001)

油菜是我國(guó)重要的油料作物之一，對(duì)油菜的改良有傳統(tǒng)育種和現(xiàn)代分子生物學(xué)育種改良2種方法。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，將某些生物的特定基因轉(zhuǎn)移到油菜中去，使其出現(xiàn)油菜不具有的農(nóng)藝性狀或產(chǎn)物，此類統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)基因油菜，轉(zhuǎn)基因油菜可抗除草劑、抗病蟲害等。而以轉(zhuǎn)基因作物作為原料進(jìn)行生產(chǎn)、加工得到的食品被稱為轉(zhuǎn)基因作物食品[1]。隨著基因工程研究不斷發(fā)展，許多轉(zhuǎn)基因植物如抗病毒木瓜、棉花等開始大面積種植、銷售。由于轉(zhuǎn)基因作物不是自然產(chǎn)物，安全風(fēng)險(xiǎn)存在爭(zhēng)論，并且受到了各國(guó)政府的高度重視，并要求對(duì)不符合自己規(guī)定閾值的產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)[2]。我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)管理嚴(yán)格，產(chǎn)品中含有某種轉(zhuǎn)基因成分必須標(biāo)識(shí)[3]。我國(guó)政府相關(guān)職能部門每年對(duì)省市縣作物產(chǎn)品進(jìn)行不定期抽查監(jiān)督，但由于目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)尚處于起步階段，很多檢測(cè)機(jī)構(gòu)、設(shè)施及相關(guān)配套資金不足，使得檢測(cè)范圍、區(qū)域有限。筆者選擇甘孜州瀘定縣區(qū)域內(nèi)售賣油菜種子或者種植油菜籽粒作為抽取對(duì)象，隨機(jī)抽取瀘定縣農(nóng)資市場(chǎng)售賣的油菜種子樣品6份，種植油菜成熟籽粒樣品12份，采用相關(guān)國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行了定性PCR核酸檢測(cè)分析，以期為該縣售賣和種植油菜的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)調(diào)查提供數(shù)據(jù)，并為政府制定相關(guān)轉(zhuǎn)基因食品安全政策提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜轉(zhuǎn)基因材料購(gòu)自歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和計(jì)量研究所(IRRM)，待測(cè)樣品均為隨機(jī)抽取甘孜州瀘定縣油菜主產(chǎn)區(qū)內(nèi)售賣的油菜種子或種植的油菜籽粒。

1.2 主要試劑

PCR擴(kuò)增引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成；植物基因組提取試劑盒、Master Mix、標(biāo)準(zhǔn)分子量(M)購(gòu)于成都博瑞克生物技術(shù)有限公司；CTAB、SDS等生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 核酸抽提

樣品核酸抽提按照植物基因組提取試劑盒方法進(jìn)行[4]。

1.4 PCR檢測(cè)

1.4.1 基因及引物 根據(jù)轉(zhuǎn)基因油菜調(diào)控元件選擇油菜中常用的外源基因花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(P-CaMV 35S)、玄參花葉病毒啟動(dòng)子(P-FMV 35S)、花椰菜花葉病毒終止子(T-CaMV 35S)和豌豆的核酮糖-1,5二磷酸羧化酶E9基因小亞基3′端序列終止子(T-E9 3′)4個(gè)基因作為篩查檢測(cè)基因，特異性引物序列引用國(guó)家、行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或自設(shè)序列(表1)。將各檢測(cè)基因上下游引物濃度稀釋為10 μmol/L。

表1 引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及檢測(cè)依據(jù)

1.4.2 PCR產(chǎn)物 反應(yīng)體系東洋紡2×Master Mix 10 μL，上下游引物F、R各0.8 μL，樣品DNA模板1.5 μL，加雙蒸水至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃保持3 min，4℃保存。

1.5 電泳峰值

PCR反應(yīng)結(jié)束后，核酸通過超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并將其濃度稀釋至25 ng/μL，經(jīng)過定性PCR反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Qiagen QIAxcel Advanced毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行分離分析，獲得外源基因的電泳峰值典型圖譜。

2 結(jié)果與分析

由表2和圖1～5外源基因的電泳峰值典型圖譜可見，18份油菜樣品未檢測(cè)到油菜外源基因P-FMV 35S(172 bp)、P-CaMV 35S(195 bp)、T-CaMV 35S(134 bp)、T-E9 3′(265 bp)。

表2 樣品信息及外源基因

3 結(jié)論與討論

分析樣品為種子或籽粒，總DNA提取純化均相對(duì)容易且含量豐富，樣品的選定為核酸分析工作奠定了良好的基礎(chǔ)。為了提高轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的分析效果，研究采用分辨率更高、峰圖更直觀、清晰的毛細(xì)管電泳引入到PCR檢測(cè)體系中。目前毛細(xì)管電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)及有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、核酸的分離分析等方面[6-7]。通過典型圖譜可以看到毛細(xì)管電泳的峰形圖好，有利于分析研究，此分析方法分辨率可達(dá)2～3個(gè)堿基，但由于分辨率太高，校準(zhǔn)條帶的微小偏差將導(dǎo)致有的目標(biāo)峰與實(shí)際峰偏差1～2個(gè)堿基，均屬于誤差范圍內(nèi)，可認(rèn)為是同一物質(zhì)，如需進(jìn)一步判斷物質(zhì)的準(zhǔn)確性可通過核酸序列分析。

2018年是生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第23年，據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國(guó)際服務(wù)組織(ISAAA)統(tǒng)計(jì)全球共26個(gè)國(guó)家1 700萬(wàn)名農(nóng)民種植了1.917億hm2的轉(zhuǎn)基因作物，油菜種植面積占1 010萬(wàn)hm2[8]。試驗(yàn)選擇檢測(cè)對(duì)象時(shí)，也正是考慮到了當(dāng)前瀘定縣涉及種植面積較大的經(jīng)濟(jì)作物，所以選擇了油菜作為檢測(cè)分析對(duì)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，瀘定區(qū)域內(nèi)所售賣或種植的油菜未檢測(cè)到P-FMV 35S、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S、T-E9 3′等外源轉(zhuǎn)基因成分，說明相關(guān)職能部門做的宣傳監(jiān)督工作到位以及種植者合法種植。但由于研究采取隨機(jī)抽樣獲得油菜樣品，測(cè)試樣品中未檢測(cè)到相關(guān)外源轉(zhuǎn)基因成分，這并不能說明該區(qū)域內(nèi)售賣或種植的油菜中不含這些外源基因的油菜品種。因此仍需相關(guān)職能部門加強(qiáng)監(jiān)管，重視農(nóng)產(chǎn)品的來(lái)源，定期對(duì)市場(chǎng)中的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行抽檢，為消費(fèi)者提供消費(fèi)選擇，保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。