李 歡， 康秀晗， 李德飛， 陳惠查， 黃家權(quán)

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006； 2.海南省眾邑新材料研究院有限公司， 海南 三亞 572025； 3.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院海南省熱帶生物可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 ?？?570228； 4.貴州省威寧自治縣黑石頭鎮(zhèn)第二小學(xué)， 貴州 威寧 553105)

柑橘黃龍病(HLB)又叫青果病，是世界柑橘生產(chǎn)中毀滅性的病害之一，有柑橘“癌癥”之稱，感病果園通常在5～8年內(nèi)就會(huì)全園覆滅，目前該病已在全球超過(guò)40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行[1]。黃龍病的病原物是一種難以培養(yǎng)的韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性菌[2]，目前已知的黃龍病菌有亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus，Las)、非洲種(Ca. L. africanus, Laf)和美洲種(Ca. L. americanus, Lam)3個(gè)種[3]，其中Las分布最廣，也是我國(guó)柑橘黃龍病發(fā)生的致病種[4]。柑橘黃龍病主要通過(guò)帶病接穗嫁接和柑橘木虱交叉取食傳播[5]，其中Las和Lam主要通過(guò)亞洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)、Laf主要通過(guò)非洲柑橘木虱(Triozaerytreae)傳播[6]。目前對(duì)柑橘黃龍病的病原菌雖已有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但由于黃龍病菌尚未實(shí)現(xiàn)體外人工培養(yǎng)，對(duì)其生物學(xué)特性知之甚少，導(dǎo)致抗病品種和有效藥劑缺乏，對(duì)柑橘黃龍病的控制僅限于預(yù)防水平。同時(shí)，柑橘黃龍病典型癥狀包括果實(shí)出現(xiàn)“紅鼻子果”[7]、葉片均勻或斑駁黃化[1]等，這與一些缺鋅、缺鎂等缺素癥，以及病毒病危害癥狀相似，因此，黃龍病癥狀診斷具有較大的主觀性。建立快速、有效、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)和診斷方法，有助于及早清除病原，防止黃龍病擴(kuò)散蔓延。同時(shí)，研究黃龍病菌在不同自然氣候條件下寄主植物體內(nèi)的分布和含量水平，有助于加深對(duì)其生物學(xué)特性及其在寄主植物體內(nèi)擴(kuò)散定殖特性和致病機(jī)理的研究。

由于病原菌在宿主植株內(nèi)的低含量、不均勻分布等，使得傳統(tǒng)的PCR方法對(duì)黃龍病菌在宿主植株或者昆蟲體內(nèi)的持續(xù)檢測(cè)無(wú)論是在準(zhǔn)確性還是靈敏性等方面都存在缺陷[8-9]。LI等[10]的研究表明：利用Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR)技術(shù)檢測(cè)黃龍病菌與傳統(tǒng)PCR相比，具有高靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，高重復(fù)率和低污染等優(yōu)點(diǎn)，且RT-qPCR可對(duì)DNA進(jìn)行定性定量的檢測(cè)和分析，因此該方法是研究確診與檢測(cè)黃龍病菌在宿主植株體內(nèi)含量和分布的有效手段。TEIXEIRA等[11]在圣保羅州和巴西兩地對(duì)甜橙葉片進(jìn)行黃龍病美洲種(Lam)的檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其在葉片中分布不均，在無(wú)癥狀的葉片中未檢測(cè)出黃龍病菌，而在斑駁型黃化癥狀的葉片中檢測(cè)出較高濃度的黃龍病菌，中脈組織中平均含量達(dá)到107個(gè)/g。TATINENI等[12]發(fā)現(xiàn)感病柑橘根、皮、葉、花、果實(shí)中均含有黃龍病菌，而在種子胚胎和胚乳中未能發(fā)現(xiàn)。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃龍病菌可以感染柑橘植株多個(gè)組織，且在不同組織中含量差異巨大，地上部組織中平均含量達(dá)1010個(gè)/g，病菌含量從接種位點(diǎn)向上下兩側(cè)逐漸蔓延增多。

我國(guó)南方地區(qū)柑橘黃龍病發(fā)生嚴(yán)重，隨著海南省柑橘種植面積的不斷擴(kuò)大，面臨的潛在威脅也越來(lái)越大。針對(duì)海南省柑橘黃龍病的發(fā)生狀況，筆者參考LI等[10]的方法，以植物細(xì)胞色素氧化酶(COX)引物探針組(COXfpr)為內(nèi)參，用黃龍病特異的引物探針組(HLBaspr)對(duì)海南省不同品種、不同組織部位的Las進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)分析，以期建立一種不依賴于癥狀的高準(zhǔn)確性HLB分子診斷方法，了解海南省柑橘黃龍病的整體分布概況，供研究黃龍病菌在柑橘體內(nèi)發(fā)生發(fā)展規(guī)律參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年4—5月對(duì)海南省臨高縣新盈農(nóng)場(chǎng)的5年生紅肉蜜柚、澄邁縣福山果園的10年生紅江橙各選4株疑似黃龍病株，每株按新葉、老葉、新梢、莖稈、次級(jí)根、主根等分部位取樣，其中葉片按顯癥(斑駁黃化型)和不顯癥(表型正常)分類采集；對(duì)瓊中縣、屯昌縣、儋州市的柑橘園各選4株疑似黃龍病株的顯癥或不顯癥葉片取樣，并以瓊中縣苗圃基地種植于溫室大棚的紅江橙作陰性對(duì)照。

1.2 樣品總DNA提取

用清水將植株組織沖洗干凈，分別稱取200 mg(葉片取中脈，新梢、莖稈取表皮)。采用TIANGEN公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DNAsecure Plant Kit，DP320)提取各組織樣品的DNA，懸浮于150 μL TE洗脫緩沖液中，-20℃保存待用。用Nanodrop 2000-超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA濃度。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)病原菌

qPCR參照LI等[10]的方法并稍作修改。黃龍病引物為HLBas/HLBr，探針為HLBp；內(nèi)參基因引物為COXf/COXr，探針為COXp。反應(yīng)體系為20 μL: 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) : 10 μL，250 nM黃龍病引物HLBas/HLBr:各0.5 μL，150 nM探針HLBp:0.3 μL，300 nM內(nèi)參引物COXf/COXr:各0.3 μL，150 nM內(nèi)參探針:0.3 μL，DNA模板:5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性20 s，然后95℃ 1 s，58℃ 40 s，共50個(gè)循環(huán)。每個(gè)DNA樣品重復(fù)測(cè)定3次，每次測(cè)定均帶1個(gè)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。使用德國(guó)QIAGEN生產(chǎn)的Rotor-Gene Q儀器進(jìn)行Rt-qPCR，各引物和探針均由上海生工生物股份有限公司合成，qPCR試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.4 Las濃度計(jì)算

采用LI等[14]的廣譜線性回歸方程：Y=13.82-0.286 6X對(duì)Las進(jìn)行定量分析。其中Y代表DNA模板濃度的Lg值，X代表RT-qPCR后的熒光閾值(CT值)，由于qPCR中5 μL的DNA模板是從200 mg植株組織中提取的并懸浮于150 μL TE洗脫緩沖液中，且基于Las 16S rDNA設(shè)計(jì)的序列中，每個(gè)病原菌細(xì)胞中含有2份靶DNA，故最終Las的濃度為10Y×150×5/2(個(gè)/g)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-qPCR檢測(cè)Las

對(duì)感染了Las的臨高紅肉蜜柚樣品DNA進(jìn)行10倍的連續(xù)濃度梯度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋(表1)后進(jìn)行qPCR。檢測(cè)結(jié)果表明：HLBaspr引物探針組在DNA稀釋到10-5時(shí)，每5 μL DNA中仍能檢測(cè)到Las(圖1)，而稀釋到10-6時(shí)則收集不到熒光信號(hào)。因此，使用HLBaspr引物探針組對(duì)黃龍病的檢測(cè)下限為10-5稀釋度，相當(dāng)于每67 ng新鮮葉片中脈組織中含有一個(gè)靶DNA(200 mg÷150 μL×10-5×5 μL)，即Las在葉中脈組織的含量約1.49×107份DNA/g。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Taqman)的靈敏度檢測(cè)

2.2 Las在紅肉蜜柚和紅江橙各部位中的含量

對(duì)臨高縣的紅肉蜜柚和澄邁縣的紅江橙2品種各3株疑似黃龍病感病植株按主根、次級(jí)根、莖、新梢、老葉、新葉6個(gè)部位取樣進(jìn)行qPCR。檢測(cè)結(jié)果(表2)表明：紅肉蜜柚和紅江橙植株各部位均可檢測(cè)出Las病原菌，且各部位Las的含量差異較大。紅肉蜜柚各部位Las的含量從次級(jí)根、老葉、主根、新葉、莖、新梢依次降低，差異水平在4個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)變化(圖2)，變化范圍從1×107個(gè)/g～3×1011個(gè)/g，其中次級(jí)根含量達(dá)2.31×1011個(gè)/g，新梢含量為1.15×107個(gè)/g；紅江橙各部位Las含量從新葉、老葉、新梢、莖、次級(jí)根、主根依次降低，差異水平在3個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)變化，變化范圍從1×109個(gè)/g～4×1011個(gè)/g，其中新葉含量達(dá)3.65×1011個(gè)/g，主根含量為1.51×109個(gè)/g。從整體結(jié)果看，紅肉蜜柚各部位COXfpr的CT值較穩(wěn)定且正常，而紅江橙主根和次級(jí)根COXfpr的CT值偏高，這可能與感病植株部分根死亡，DNA被降解，致檢測(cè)條件下的基因組DNA的濃度相對(duì)較低有關(guān)。

表2 RT-qPCR 定量檢測(cè)紅肉蜜柚和紅江橙不同組織中黃龍病菌的循環(huán)閾值及其含量

2.3 黃龍病顯癥與不顯癥葉片中Las的含量

對(duì)采自臨高縣的紅肉蜜柚和澄邁縣的紅江橙2個(gè)品種的斑駁黃化型與表型正常的老葉、新葉中脈進(jìn)行qPCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖3)：2個(gè)品種的新葉和老葉中脈均能檢測(cè)出Las，且斑駁黃化型葉片Las含量高于表型正常葉片，含量差異在老葉中表現(xiàn)得尤為突出，斑駁黃化型較表型正常老葉高出104～106倍，新葉則僅高出10～100倍。紅江橙新葉Las含量高于紅肉蜜柚，老葉中二者含量相差不大。

2.4 海南省柑橘黃龍病的qPCR檢測(cè)

采用Taqman探針RT-qPCR法對(duì)海南省瓊中縣、澄邁縣、屯昌縣、臨高縣、儋州市等柑橘主產(chǎn)區(qū)主栽的紅肉蜜柚、水晶蜜柚、甜橙、福橙、檸檬等品種的疑似黃龍病樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明(表3)：在主產(chǎn)區(qū)采集的23個(gè)疑似黃龍病樣品DNA樣品中，只有來(lái)自儋州市的其中1份水晶蜜柚樣品檢測(cè)呈陰性，其余的樣品中均檢測(cè)出了黃龍病菌，Ct值介于16～31.78。說(shuō)明海南省柑橘主栽區(qū)均受到了不同程度的黃龍病菌危害。

表3 RT-qPCR對(duì)海南省柑橘黃龍病疑似樣品檢測(cè)循環(huán)閾值

3 結(jié)論與討論

1) 本研究應(yīng)用Taqman探針qPCR法在海南省感病紅肉蜜柚和紅江橙的主根、次級(jí)根、莖、新梢、老葉、新葉等6個(gè)組織中都檢測(cè)出Las，且Las在各組織或同一組織不同品種間的含量差異較大，與TATINENI等[12]、LI等[13]、婁兵海等[15]研究的分布、定殖特性一致。LI[13]的研究表明Las的含量在103范圍內(nèi)波動(dòng)，不同組織中平均含量介于7×108～2×1011個(gè)/g，而本研究發(fā)現(xiàn)Las在不同組織中含量差異顯著，平均含量在104個(gè)/g范圍內(nèi)波動(dòng)，介于1×107～3×1011個(gè)/g，且紅肉蜜柚中次級(jí)根的Las含量最高，紅江橙新葉中脈的Las含量最高，原因可能是由于柑橘品種以及所處發(fā)病時(shí)期不同引起的差異。TEIXEIRA等[11]對(duì)斑駁黃化型和表型正常型葉片進(jìn)行了Lam的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在不同顯癥葉片中黃龍病菌分布差異巨大，且斑駁黃化型葉片含量較高，與本研究結(jié)果相一致。但TEIXEIRA等[11]的研究?jī)H在斑駁黃化型葉片中檢測(cè)到Lam，而在無(wú)癥狀葉片中并未檢測(cè)出，本研究在紅肉蜜柚和紅江橙2個(gè)品種的斑駁黃化型和表型正常型的新葉和老葉中均檢測(cè)出了Las，且斑駁黃化型葉片Las含量均高于表型正常葉片，該結(jié)果的差異可能是試驗(yàn)品種、取樣時(shí)間和檢測(cè)方法不同導(dǎo)致。

2) 黃龍病葉片是否斑駁黃化和有“紅鼻子”果出現(xiàn)，通常是田間快速診斷的依據(jù)，但LOPES等[16]研究認(rèn)為，斑駁黃化癥狀在高溫時(shí)會(huì)消退而影響診斷。LI等[10]、胡浩等[17]研究表明，Taqman探針?lè)ㄝ^傳統(tǒng)的PCR和SYBR Green I熒光染料法有更高的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，本研究采用Taqman探針?lè)z測(cè)Las的極限為10-5稀釋度，與LI等[10]的結(jié)果一致，而與胡浩等[17]的檢測(cè)極限10-8稀釋度存在差異，可能是因品種差異造成。

3) 關(guān)于Las的濃度計(jì)算，采用LI等[14]證明的對(duì)不同地區(qū)、不同柑橘品種和不同組織部位都適用的廣譜線性回歸方程進(jìn)行定量。ZHANG等[18]研究認(rèn)為，使用該定量方法，當(dāng)CT值大于36.0時(shí)，即視為檢測(cè)結(jié)果為陰性。本次檢測(cè)中僅1份樣品(儋州水晶蜜柚CT= 38.55)CT值大于36.0，即檢測(cè)結(jié)果為陰性，可認(rèn)為該樣品尚未感染黃龍病菌。

4) 海南省是優(yōu)良柑橘種植區(qū)，柑橘產(chǎn)業(yè)是拉動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展不可或缺的產(chǎn)業(yè)，因此對(duì)柑橘黃龍病這種毀滅性病害進(jìn)行檢測(cè)，為預(yù)防該病流行有深遠(yuǎn)意義。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Las已在海南各柑橘產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)，且情況嚴(yán)重。本研究使用的Taqman探針RT-qPCR法可快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)海南省柑橘Las，可作為一種穩(wěn)定可靠的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)推廣應(yīng)用。