殷文娟，張 玲，劉青華，白 瑋，王志華，李雅俊，李靈敏

淋巴道轉(zhuǎn)移是喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)主要的轉(zhuǎn)移方式，對(duì)腫瘤預(yù)后復(fù)發(fā)有重要影響[1-2]。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，淋巴管生成伴微淋巴管密度(micro-lymphatic vessel density, MLVD)增加，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管提供了更多可能。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)是VEGF家族最重要的因子之一，被認(rèn)為是能誘導(dǎo)腫瘤淋巴管新生及促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素[3-4]。

近期研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)BRCA1相關(guān)蛋白(BRCA1-associated protein, BRAP)與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本文檢測(cè)84例LSCC組織中BRAP和VEGF-C蛋白表達(dá)，探討兩種蛋白在LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用關(guān)系及對(duì)MLVD的影響，為進(jìn)一步闡明LSCC的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011年1月～2013年12月山西省腫瘤醫(yī)院LSCC患者手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本84例?；颊咝g(shù)前均未行放、化療，其中男性81例，女性3例，年齡38～79歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者64例。另收集距癌組織邊緣0.5 cm以上的癌旁組織標(biāo)本15例作為對(duì)照組。所有組織標(biāo)本由山西省腫瘤醫(yī)院病理科醫(yī)師確診，患者均有完整的臨床資料。

1.2 試劑BRAP、VEGF-C兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；鼠抗人D2-40單克隆抗體(工作液)購(gòu)自Zsbio公司；免疫組化PV 6000試劑盒購(gòu)自Zsbio公司。

1.3 免疫組化采用免疫組化PV 6000法染色，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。BRAP、VEGF-C兔抗人多克隆抗體工作濃度分別為1 ∶400和1 ∶200，同時(shí)用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師采用半定量分析法判定。BRAP、VEGF-C蛋白均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。參考Liu等[6]方法，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞著色程度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞著色計(jì)分：細(xì)胞無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相加為蛋白的表達(dá)水平：0～3分為低表達(dá)，4～6分為高表達(dá)。

1.5 MLVD計(jì)數(shù)D2-40表達(dá)于微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色。微淋巴管計(jì)數(shù)參考Zheng等[7]方法，先在100倍鏡下尋找微淋巴管最密集的2個(gè)區(qū)域即“熱點(diǎn)”，然后200倍鏡下在每個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行微淋巴管計(jì)數(shù)(不包括管腔直徑超過(guò)8個(gè)紅細(xì)胞或管壁存在平滑肌的淋巴管)。結(jié)果采用2個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域合計(jì)10個(gè)視野內(nèi)微淋巴管數(shù)目的平均值作為MLVD。

2 結(jié)果

2.1 LSCC及癌旁組織中BRAP和VEGF-C的表達(dá)免疫組化PV 6000法檢測(cè)84例LSCC及15例癌旁組織中BRAP、VEGF-C的表達(dá)，兩種蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)中，呈淺黃至棕色(圖1、2)。LSCC組織中BRAP、VEGF-C的高表達(dá)率分別為65.5%、53.6%，明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 LSCC組織中BRAP、VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中BRAP、VEGF-C表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中BRAP、VEGF-C表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3 BRAP與VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性84例LSCC組織中，BRAP和VEGF-C同時(shí)高表達(dá)者37例，高表達(dá)率為44.0%，同時(shí)低表達(dá)者21例，低表達(dá)率為25.0%。LSCC組織中BRAP與VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)(χ2=12.024，P<0.01，C=0.354，表3)。

表3 BRAP與VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性

2.4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MLVD值的關(guān)系D2-40陽(yáng)性定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色(圖3)。在LSCC組織中，D2-40位于癌周。LSCC組織和癌旁組織MLVD值分別為16.39±4.55、7.27±2.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.927，P<0.01)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MLVD值高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.387，P<0.01，表4)。

2.5 BRAP、VEGF-C表達(dá)與MLVD的關(guān)系比較BRAP、VEGF-C蛋白不同表達(dá)組的MLVD值，結(jié)果顯示高表達(dá)BRAP、VEGF-C組MLVD值分別高于低表達(dá)組(P<0.01，表5)。

①A①B②A(yíng)②B③圖1 喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中BRAP的表達(dá),PV 6000法:A.癌旁組織;B.LSCC組織圖2 喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中VEGF-C的表達(dá),PV 6000法:A.癌旁組織;B.LSCC組織圖3 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中D2-40的表達(dá),PV 6000法

表4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MLVD的關(guān)系

表5 BRAP、VEGF-C表達(dá)與MLVD的關(guān)系

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中BRAP、VEGF-C的表達(dá)

3 討論

LSCC是耳鼻咽喉科常見(jiàn)的惡性腫瘤，其主要發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移直接影響LSCC的治療方式、局部復(fù)發(fā)和預(yù)后[8]。因此，分析LSCC淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制對(duì)LSCC的早期診斷、及時(shí)治療具有非常重要的意義。

BRAP又稱(chēng)BRCA1相關(guān)蛋白，能夠識(shí)別BRCA1的信號(hào)肽。BRAP調(diào)控細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、侵襲、遷移[9-10]。既往研究顯示BRAP基因多態(tài)性和結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[11]。Zhao等[10]研究顯示BRAP是食管癌細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)基因，并促進(jìn)裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的形成。我們最近發(fā)現(xiàn)BRAP在LSCC組織中高表達(dá)，且其表達(dá)與LSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。

VEGF-C是VEGF家族成員，被認(rèn)為是重要的淋巴管內(nèi)皮生長(zhǎng)刺激因子，其在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[4]。VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體VEGFR-3特異性結(jié)合后，刺激靶細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)淋巴管的增生及MLVD增高，促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3]。已有研究證實(shí)在多種惡性腫瘤包括喉癌中，VEGF-C高表達(dá)促進(jìn)MLVD增高，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7,12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BRAP、VEGF-C在LSCC組織中均呈高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示兩者在LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中有促進(jìn)作用。BRAP、VEGF-C高表達(dá)時(shí)MLVD值均顯著增高，提示BRAP、VEGF-C可能通過(guò)誘導(dǎo)淋巴管生成促進(jìn)LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，BRAP與VEGF-C在LSCC中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在LSCC的淋巴管生成及轉(zhuǎn)移中呈協(xié)同作用。Ozaki等[13]對(duì)冠脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究證實(shí)敲降BRAP的表達(dá)可以抑制NF-κB信號(hào)通路，而VEGF-C是NF-κB調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移重要的下游通路；Zhao等[10]對(duì)食管癌的研究中，從免疫組化染色和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BRAP和VEGF-C的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，且BRAP對(duì)VEGF-C的調(diào)控是通過(guò)NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。以上研究與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中BRAP與VEGF-C呈顯著正相關(guān)結(jié)果一致，提示LSCC中高表達(dá)的BRAP有可能通過(guò)NF-κB途徑刺激VEGF-C的表達(dá)。目前，關(guān)于BRAP在LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制及其與VEGF-C的關(guān)系尚待進(jìn)一步分析。

綜上所述，BRAP、VEGF-C在LSCC中高表達(dá)，均與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。抑制BRAP的表達(dá)，可能通過(guò)下調(diào)VEGF-C而減少淋巴管生成及淋巴道轉(zhuǎn)移的概率。