杭 月，林昌岫，黃成日

卵巢癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，早期癥狀不典型，大部分患者就診時(shí)已處于晚期，其中卵巢癌增殖、侵襲和遷移是影響治療、預(yù)后的主要原因[1]。尋找抑制卵巢癌增殖、侵襲和遷移的靶點(diǎn)對(duì)于緩解疾病意義重大。神經(jīng)鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase, SMS)是神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin, SM)合成途徑的最后一個(gè)酶，在卵巢癌中上調(diào)SMS1可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化后識(shí)別卵巢癌細(xì)胞表面抗原，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡[2]，但尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。SMS活性改變與SM、甘油二酯(diacylglycerol, DAG)、卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)、神經(jīng)酰胺(ceramide, Cer)水平變化有關(guān)[3]，SMS活性改變是否因其影響卵巢癌細(xì)胞中SM、DAG、PC、Cer水平的變化，從而影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)低表達(dá)SMS1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，旨在探討SMS1與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為卵巢癌的早期診斷及靶向治療積累臨床數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 人卵巢癌細(xì)胞系HO8910及人正常卵巢上皮細(xì)胞系Hose，購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞系。

1.1.2試劑 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reation, qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自Takara公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自SIGMA公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司。引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)：卵巢癌細(xì)胞HO8910復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，(10%胎牛血清、5%CO2、37 ℃飽和濕度)，3～5天待接種細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)瓶底面后，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]及siRNA技術(shù)要求，設(shè)計(jì)針對(duì)SMS1的siRNA，采用國(guó)際通用與所有基因均無(wú)同源性序列的non-target siRNA為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于6孔(5.0×104個(gè)/孔)板中，siRNA組為實(shí)驗(yàn)組，siRNA-NC轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照組(negative control, NC)，利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染SMS1-siRNA、siRNA-NC，無(wú)轉(zhuǎn)染組為空白對(duì)照組(blank control, BC)，轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞SMS1蛋白表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，篩選穩(wěn)定表達(dá)SMS1的細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，接種于96孔板中(1×104個(gè)/孔)，重復(fù)5孔，每孔培養(yǎng)基總量為200 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)(5%CO237 ℃)，分別于0、12、24、36、48、60、72 h時(shí)，每孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT溶液(每孔為20 μL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO，利用自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處檢測(cè)各孔光吸收值(A值)，繪制細(xì)胞活力曲線(xiàn)。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在6孔板中鋪板(1×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)過(guò)夜，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，單層生長(zhǎng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)6孔板時(shí)，10 μL滅菌移液器頭在細(xì)胞上垂直劃痕，PBS洗去劃痕中細(xì)胞，加入空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、48 h后選取5個(gè)視野，測(cè)量細(xì)胞中間劃痕寬度。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心后加入空白培養(yǎng)基，混勻。Transwell小室上層加入基質(zhì)膠Matrigel，將細(xì)胞在Transwell小室上層鋪板(1×105個(gè)/孔)，下室預(yù)先加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，倒出培養(yǎng)基，PBS沖洗，風(fēng)干、4%多聚甲醛固定，加入0.14%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.5SMS酶活檢測(cè) 消化、收集轉(zhuǎn)染成功后細(xì)胞，胰蛋白酶消化后勻漿、離心后取上清液，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，37 ℃ 5 h，氯仿/甲醇抽提，干燥后，利用薄層層析法檢測(cè)SMS1酶活。

1.2.6細(xì)胞內(nèi)SM、PC、Cer水平測(cè)定 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SM、PC：消化、收集轉(zhuǎn)染成功后的細(xì)胞，萃取脂質(zhì)，加入酶顯色劑，孵育45 min后，利用自動(dòng)酶標(biāo)儀于595 nm處檢測(cè)吸光度(配制不同濃度SM、PC，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)得吸光度對(duì)應(yīng)的SM、PC濃度)；Cer檢測(cè)：萃取脂質(zhì)，加入含有DAG的緩沖液中孵育30 min，利用薄層層析法檢測(cè)Cer水平。

2 結(jié)果

2.1 正常卵巢細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中SMS1 mRNA及蛋白的表達(dá)卵巢癌HO8910細(xì)胞中SMS1 mRMA及蛋白表達(dá)水平比正常卵巢細(xì)胞顯著升高(1.03±0.02vs2.74±0.01，t=187.321，P<0.05，圖1)。

圖1 正常卵巢細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞中SMS1 mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)：與正常組相比，*P<0.05

2.2 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞中SMS1 mRMA及蛋白表達(dá)量轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA(0.47±0.02)組細(xì)胞中SMS1 mRMA及蛋白相對(duì)表達(dá)量較NC組(1.07±0.02)與BC組(1.04±0.01)均顯著降低(t=51.962、62.440，P<0.05，圖2)。

圖2 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SMS1 mRMA(A)及蛋白(B)的表達(dá)：與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與空白對(duì)照組相比，#P<0.05

2.3 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞內(nèi)SMS1酶活變化轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA組(0.76±0.03)細(xì)胞中SMS1酶與NC組(1.04±0.01)、BC組(1.02±0.02)相比，其顯著降低(t=21.689、17.664，P<0.05，圖3)。

圖3 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)SMS1酶活變化：與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與空白對(duì)照組相比，#P<0.05

2.4 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞增殖siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后siRNA組A570與BC、NC組相比，其顯著降低(P<0.05，圖4)。

圖4 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖：與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05；與空白對(duì)照組相比，#P<0.05

2.5 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞的遷移和侵襲能力轉(zhuǎn)染后，siRNA組遷移指數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)與BC、NC組相比，其顯著降低(P<0.05，表2，圖5)。

2.6 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞中Cer、PC、SM水平轉(zhuǎn)染后，siRNA組HO8910細(xì)胞中SM水平與NC、BC組相比，其顯著降低(P<0.05)；siRNA組HO8910細(xì)胞中Cer水平與NC、BC組相比，其顯著升高(P<0.05)；siRNA組HO8910細(xì)胞中PC水平與NC、BC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

圖5 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞的遷移、侵襲

表2 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞的遷移和侵襲能力

3 討論

SMS有SMS1和SMS2兩種同工酶，其中SMS1定位于順面高爾基體，與SM的生物合成有關(guān)，SMS1活性對(duì)于保持腎乳頭收集管細(xì)胞中細(xì)胞與細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[6]；SMS1影響膜運(yùn)輸，是細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程的重要酶[7]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，敲除SMS1可抑制胚胎成纖維細(xì)胞的增殖[8]；下調(diào)SMS1抑制癌細(xì)胞增殖從而改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后[9]。SMS1水平可影響癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HO8910腫瘤細(xì)胞中SMS1 mRNA及蛋白表達(dá)水平高于正常卵巢細(xì)胞，在卵巢中可能SMS1水平的升高影響細(xì)胞是否發(fā)生癌變，對(duì)于卵巢癌的檢測(cè)意義重大。轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-SMS1組卵巢癌細(xì)胞中SMS1酶活降低，驗(yàn)證siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染HO8910細(xì)胞成功。轉(zhuǎn)染siRNA-SMS1后，HO8910細(xì)胞增殖能力、遷移、侵襲能力均降低，提示沉默SMS1基因?qū)е乱幌盗行盘?hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的作用而抑制，最終實(shí)現(xiàn)抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖，降低其遷移及侵襲能力，但是具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 siRNA-SMS1轉(zhuǎn)染后HO8910細(xì)胞中SM、PC、Cer水平

SMS1活性改變可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)Cer、PC、SM及DAG等水平變化，進(jìn)一步影響細(xì)胞功能?？纱呋涞孜顲er及PC，生成SM及DAG。Cer、DAG可能與細(xì)胞凋亡、老化有關(guān)。其中Cer作為體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，可特異性連接細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與多種生物學(xué)反應(yīng)[10]。呂勇剛等[11]的研究結(jié)果證明，Cer可呈劑量依賴(lài)性地促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率；可能作為抑癌脂質(zhì)，參與細(xì)胞自噬調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]；Cer可能通過(guò)PI3K/mTOR等信號(hào)途徑參與肝癌[13]、子宮內(nèi)膜癌[14]等疾病的發(fā)生、發(fā)展。此外，Cer還可能與細(xì)胞遷移、粘連、分化、衰老有關(guān)，可能與細(xì)胞增殖、侵襲有關(guān)[15-16]。SM是組成細(xì)胞質(zhì)、膜的主要磷脂之一，參與調(diào)節(jié)多種基質(zhì)蛋白及受體的活動(dòng)，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控有關(guān)，可通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[17-18]，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；水平變化可能與神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HO8910轉(zhuǎn)染siRNA-SMS1后，siRNA組HO8910細(xì)胞中SM水平顯著降低，Cer水平顯著升高，提示沉默SMS1表達(dá)使SMS1催化作用減弱，對(duì)Cer的作用減弱，對(duì)其消耗量減少，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)積累，進(jìn)而抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖、侵襲與遷移；同時(shí)SM因Cer的催化作用減弱，生成SM的量降低，同樣抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖、侵襲與遷移。

綜上所述，SMS1基因沉默后卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞遷移、侵襲能力下降，可能與SMS1基因沉默引起SM水平降低、Cer水平升高有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)初步觀察SMS1對(duì)卵巢癌表觀指標(biāo)的影響，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步分析。