孫浩然，李 霄，李 濤，化宏金，范欽和，劉 沖

WHO(2017)血液與淋巴造血組織腫瘤分類將朗格漢斯組織細(xì)胞增生癥(Langerhans cell histiocytosis, LCH)歸為抗原呈遞細(xì)胞所發(fā)生的具有腫瘤屬性的罕見病變，其主要的病理學(xué)特征是LCH細(xì)胞伴有咖啡豆樣細(xì)胞核以及電鏡下細(xì)胞質(zhì)中存在特征性的Birbeck顆粒，表達(dá)CD1a、Langerin、S-100等免疫組化標(biāo)記[1]。該病具有浸潤與破壞周圍組織的特點(diǎn)，任何器官均可受累，臨床表現(xiàn)從單一器官到全身性多器官或系統(tǒng)性累及，以骨骼和皮膚多見[2]。部分病例具有自愈現(xiàn)象，但仍有一些難治性病例具有不良的預(yù)后。典型的病變結(jié)合形態(tài)學(xué)和免疫組化標(biāo)記易于診斷，但相對于活檢小標(biāo)本，診斷仍具有挑戰(zhàn)性。近年有文獻(xiàn)報道LCH在發(fā)生、發(fā)展中存在MAPK/ERK通路基因突變的現(xiàn)象[3-5]，該通路激活下游效應(yīng)蛋白Cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的增殖行為。臨床外檢中大部分骨標(biāo)本均需要經(jīng)過脫鈣處理而導(dǎo)致核酸破壞，以至于不能進(jìn)行分子病理檢測。因此，本文采用免疫組化法檢測Cyclin D1以及主要的通路相關(guān)蛋白(BRAF、p-ERK)在骨LCH中的表達(dá)，著重探討LCH中Cyclin D1表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月～2018年12月江蘇省人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)部診斷的骨原發(fā)性LCH標(biāo)本，剔除無法獲得完整資料的病例(包括白片或蠟塊以及隨訪信息)，合計21例入組，所有病例由高年資病理醫(yī)師重新閱片。篩選28例伴有朗格漢斯細(xì)胞局限性增生的標(biāo)本作為對照組，包括朗格漢斯細(xì)胞微膿腫8例、皮膚苔蘚樣病變16例、皮膚色素沉積癥4例。

1.2 方法(1)標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林充分固定，5%～10%稀硝酸脫鈣，每間隔1 h觀察脫鈣效果，當(dāng)針刺穿透骨組織后停止脫鈣，流水去酸不少于6 h。標(biāo)本經(jīng)全自動脫水機(jī)處理，石蠟包埋，3 μm厚切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封固。(2)免疫組化采用EnVision兩步法染色，并設(shè)立陰陽性對照，所用一抗包括CD1a(O10)、S-100(4C4.9)、Langerin(CD207)、Ki-67(MIB)、Cyclin D1(SP4)、BRAF(VE1)、p-ERK(E-4)等，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。Cyclin D1陽性標(biāo)準(zhǔn)：>5%的LCH細(xì)胞核表達(dá)；p-ERK陽性標(biāo)準(zhǔn)：>5%的LCH細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；BRAF陽性標(biāo)準(zhǔn)：>20%的LCH細(xì)胞質(zhì)表達(dá)[6-7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0(IBM Corp)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。LCH組與對照組中Cyclin D1陽性率的差異采用χ2檢驗(yàn)。Cyclin D1、BRAF、p-ERK表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。不良預(yù)后事件分析采用ROC曲線法，計算陰影下面積AUC值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征21例骨原發(fā)性LCH中男性15例，女性6例；發(fā)病年齡1～50歲，中位年齡27歲；發(fā)病部位：頭面骨8例、肋骨4例、盆骨4例、股骨2例、鎖骨2例、脊柱1例；單發(fā)17例，多發(fā)4例。

2.2 病理特征骨原發(fā)性LCH主要的形態(tài)學(xué)特征是邊界不清，破壞骨質(zhì)；LCH細(xì)胞呈圓形或卵圓形，有時可見馬蹄形、花環(huán)狀或多核巨細(xì)胞；細(xì)胞膜多不清晰，細(xì)胞核偏位，可見核切跡或核溝，部分呈咖啡豆樣，核仁和核分裂象可見，且數(shù)量不等，有些病例可以出現(xiàn)假包涵體樣結(jié)構(gòu)；背景可見血湖、多量小淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，部分病例出現(xiàn)顯著的纖維化，血管多為小靜脈(表1，圖1～3)。

2.3 免疫表型(1)LCH中通用的診斷抗體CD1a、Langerin、S-100的陽性率分別為100%、100%、95%。(2)LCH組與對照組中Cyclin D1陽性定位于細(xì)胞核(圖4)，陽性率分別為100%和3.6%，χ2檢驗(yàn)顯示，Cyclin D1的陽性率在LCH組與對照組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，即Cyclin D1的表達(dá)在LCH組中顯著高于朗格漢斯細(xì)胞增生組。

表1 骨原發(fā)性朗格漢斯組織細(xì)胞增生癥病理特征(n=21)

2.4 LCH中Cyclin D1、BRAF、p-ERK表達(dá)的相關(guān)性BRAF(圖5)、p-ERK(圖6)陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性率分別為57%、76%。Spearman相關(guān)分析顯示，Cyclin D1與BRAF、p-ERK的表達(dá)均無相關(guān)性，BRAF、p-ERK的表達(dá)亦無相關(guān)性(P>0.05)。

①②③④⑤⑥

2.5 預(yù)后及隨訪21例骨原發(fā)性LCH均獲得隨訪資料，隨訪時間15～60個月，無患者死亡。有4例出現(xiàn)系統(tǒng)性多發(fā)，其中2例在初次發(fā)病后分別于13個月和23個月出現(xiàn)復(fù)發(fā)，2例未出現(xiàn)復(fù)發(fā)。以系統(tǒng)性多發(fā)(包含復(fù)發(fā))作為患者預(yù)后不良事件，同時為了便于重新界定表達(dá)閾值與不良預(yù)后事件之間的關(guān)系，所有免疫組化標(biāo)記按照陽性細(xì)胞數(shù)百分比重新計數(shù)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)核分裂象數(shù)、Ki-67、Cyclin D1、p-ERK的不同表達(dá)值對提示不良預(yù)后有參考價值(AUC>0.5，P<0.05)，而BRAF參考價值較小(AUC<0.5，P<0.05，表2)；核仁、假包涵體、纖維化、多核巨細(xì)胞等與不良預(yù)后之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 ROC曲線分析朗格漢斯組織細(xì)胞增生癥患者預(yù)后

3 討論

LCH可發(fā)生于各年齡段，以骨組織受累的影響最嚴(yán)重。外檢中通常利用CD1a、Langerin、S-100等標(biāo)記進(jìn)行輔助診斷，但是人體內(nèi)正常的朗格漢斯細(xì)胞以及朗格漢斯細(xì)胞微膿腫、皮膚苔蘚樣病變、皮膚色素沉積癥等病變組織內(nèi)也會出現(xiàn)上述標(biāo)志物的表達(dá)。此外，某些穿刺活檢組織中LCH細(xì)胞數(shù)較少和(或)伴大量的淋巴細(xì)胞浸潤的情況時有出現(xiàn)，給明確診斷帶來巨大挑戰(zhàn)，迫切需要更為有效的輔助診斷手段。Chatterjee等[6]采用免疫組化標(biāo)記比較了p53、Cyclin D1在LCH和反應(yīng)性朗格漢斯細(xì)胞增生中的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)p53和Cyclin D1可以用于兩者的鑒別，尤其以Cyclin D1特異性更高。該研究結(jié)論得到了本實(shí)驗(yàn)和其他學(xué)者[7-8]的證實(shí)，即Cyclin D1是鑒別LCH和反應(yīng)性朗格漢細(xì)胞增生的有效標(biāo)志物。

Cyclin D1的表達(dá)在惡性黑色素瘤、毛細(xì)胞白血病、甲狀腺癌、套細(xì)胞淋巴瘤等疾病中已經(jīng)得到充分的診斷應(yīng)用。其主要作用機(jī)制是Cyclin D1激活后與細(xì)胞周期依賴性激酶4/6(CDK4/6)結(jié)合形成二聚體，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1→S期的轉(zhuǎn)變，是MAPK/ERK通路中最重要的下游靶點(diǎn)之一[7]。MAPK通路又稱絲裂原活化蛋白激酶通路，該通路激活后將調(diào)控信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部，參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等調(diào)控過程[9]，研究證實(shí)該通路基因的激活對CCND1基因的轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)是必要和充分的[10]。

最近研究發(fā)現(xiàn)部分LCH中存在MAPK/ERK通路基因的突變[2-5]，其中40%～60%為BRAF V600E基因突變[3,5]，其次20%～25%的病例出現(xiàn)MAP2K1基因突變[3-4]。此外，還發(fā)現(xiàn)了諸如NRAS、ARAF和ERBB3等多種基因的突變[6,11]。本組免疫組化標(biāo)記BRAF蛋白的陽性率為57%，與文獻(xiàn)報道的基因陽性率比較一致，另有研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌、肺癌、惡性黑色素瘤中BRAF蛋白和基因表達(dá)具有較高的一致性[12-13]，因此BRAF抗體可以作為一種補(bǔ)充手段，以彌補(bǔ)經(jīng)脫鈣骨組織標(biāo)本不能進(jìn)行分子病理檢測的難題。研究表明BRAF V600E基因突變可以激活MAKP/ERK通路下游Cyclin D1效應(yīng)蛋白，這條通路也是人類惡性腫瘤的主要驅(qū)動環(huán)節(jié)之一[14]。BRAF V600E基因與MAP2K1基因還具有互斥性[6]，但本實(shí)驗(yàn)中Cyclin D1與BRAF、p-ERK的表達(dá)均無相關(guān)性，推測磷酸化的ERK蛋白缺少足夠的穩(wěn)定性，或者參與調(diào)控Cyclin D1效應(yīng)蛋白的通路可能還接受其他的通路調(diào)控導(dǎo)致MAPK/ERK途徑中上游信號基因的突變通過替代途徑激活終點(diǎn)效應(yīng)蛋白Cyclin D1[9]：如有相關(guān)研究表明LCH中存在MDM2過表達(dá)現(xiàn)象，并通過MDM2對p53及RB蛋白結(jié)合使其失活，進(jìn)而影響細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控[8]。此外，AKT通路在Cyclin D1的調(diào)控上也起重要作用[15]。盡管存在不同的分子調(diào)控通路，但最終的效應(yīng)蛋白均為Cyclin D1；提示LCH中Cyclin D1的表達(dá)對鑒別LCH和反應(yīng)性朗格漢斯細(xì)胞增生的作用是明確的[6-7]，MAPK/ERK通路基因的激活也為MAPK抑制劑治療該病提供了理論依據(jù)[11]。

影響LCH的預(yù)后與受累組織或器官的數(shù)量有關(guān)。該病系統(tǒng)性多發(fā)(含復(fù)發(fā))作為不良預(yù)后事件，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)核分裂象>3.5個/2 mm2、Ki-67增殖指數(shù)>28%、Cyclin D1>85%、p-ERK表達(dá)>52.5%均提示患者預(yù)后不良(AUC>0.5，P<0.05)。

綜上所述，Cyclin D1對鑒別骨原發(fā)性LCH與反應(yīng)性朗格漢斯細(xì)胞增生是一個有效的生物學(xué)標(biāo)志物，并能夠提示患者預(yù)后不良，其彌漫一致的表達(dá)可能與MAPE/ERK通路激活有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步分析。