閆夢麗，任新瑜，吳煥文，龐鈞譯，陳龍?jiān)?，沈松杰，梁智?/p>

三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)由于缺乏ER和PR表達(dá)及HER-2基因擴(kuò)增，治療方案非常有限，是導(dǎo)致女性乳腺癌病死率高的原因之一[1]。近年研究表明BRG1和BRM在多種腫瘤中具有重要作用并可作為抗癌治療的靶點(diǎn)[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在TNBC細(xì)胞系中，BRG1或BRM可能扮演著癌基因的作用，且與化療藥物敏感性相關(guān)[3]；但其在TNBC石蠟標(biāo)本中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系及預(yù)后作用尚不明確。因此，本文著重探討B(tài)RG1和BRM蛋白在TNBC中的表達(dá)及意義，有可能為TNBC尋找新的治療靶點(diǎn)提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2000～2011年北京協(xié)和醫(yī)院行手術(shù)切除確診為TNBC標(biāo)本197例，所有患者均有完整的臨床資料包括發(fā)病年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、p53表達(dá)、基底樣標(biāo)志物表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等；并調(diào)取染色切片重新審閱，診斷均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家重新確認(rèn)。隨訪信息均來自電話訪談或患者就診病歷查詢，包括總生存期(overall survival, OS)和無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)、治療方式、有無復(fù)發(fā)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。隨訪開始時(shí)間為確診日期，終止時(shí)間為2019年3月1日。OS以TNBC確診日期到末次隨訪日期或死亡日期計(jì)算，PFS以手術(shù)切除至乳腺癌首次疾病復(fù)發(fā)或死亡隨訪時(shí)間計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織芯片制備根據(jù)HE切片挑選代表性腫瘤區(qū)域?qū)w蠟塊進(jìn)行標(biāo)記。使用英國 Mitogen Mini Core全自動組織芯片儀進(jìn)行操作，每例標(biāo)本取3個(gè)不同位置的直徑為0.1 cm的復(fù)孔。

1.3 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法染色，實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰、陽性對照。分別檢測兔抗人BRG1多克隆抗體(Proteintech公司)和BRM單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)在TNBC組織中的表達(dá)。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn)BRG1或BRM陽性染色僅限于細(xì)胞核，以間質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為陽性內(nèi)對照。根據(jù)顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比兩項(xiàng)指標(biāo)判斷陽性等級。BRG1或BRM顯色強(qiáng)度評分為0～3分：無著色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕色為3分。陽性細(xì)胞百分比按以下四類進(jìn)行評分：0～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。兩項(xiàng)評分相乘為總得分(IRS)。最終表達(dá)水平分為陰性(IRS：0分)、弱陽性(IRS：1～4分)、中等陽性(IRS：6～8分)、強(qiáng)陽性(IRS：9～12分)。將病例分為兩組進(jìn)行分析，低表達(dá)組(陰性和弱陽性)或高表達(dá)組(中等陽性和強(qiáng)陽性)。根據(jù)EGFR、CK5/6或CK14的免疫組化結(jié)果判定TNBC是否為基底樣亞型。只要表達(dá)上述3種標(biāo)志物的1種或以上為陽性，即定義為基底樣亞型。以上結(jié)果均由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師判斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。評估TNBC中BRG1、BRM表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。分析BRG1、BRM表達(dá)對TNBC患者預(yù)后的影響用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗(yàn)。Cox單因素回歸模型分析用來納入變量，Cox多因素回歸模型分析用以調(diào)整協(xié)變量。雙側(cè)P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征197例TNBC患者均為女性?；颊咂骄挲g為50.8歲，中位年齡為49歲 (范圍：24～90歲)。組織學(xué)亞型以浸潤性非特殊類型乳腺癌(即導(dǎo)管癌)為主(185/197, 93.9%)，其余為浸潤性小葉癌和混合性癌(非特殊+小葉癌)各4例(4/197, 2.0%)，浸潤性微乳頭狀癌2例(2/197, 1.0%)，化生性癌及混合性癌(非特殊+黏液癌)各1例(1/197, 0.5%)。144例(73.1%)患者的腫瘤最大徑≤3 cm，僅4.1%的病例腫瘤最大徑>5 cm。p53陽性率占48.2%。約70%的病例組織學(xué)分級為3級。81例患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(淋巴結(jié)陽性數(shù)1～56個(gè))。67例患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。54例患者在隨訪過程中死亡(表1)。

2.2 TNBC中BRG1、BRM的表達(dá)BRG1、BRM陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核，少數(shù)BRG1免疫反應(yīng)性強(qiáng)的病例，細(xì)胞質(zhì)染色較弱(圖1)。197例TNBC中，分別有18.3%(36/197)和10.7%(21/197)的病例評定為BRG1和BRM低表達(dá)(陰性和弱陽性)，81.7%(161/197)和89.3%(176/197)的病例評定為BRG1和BRM高表達(dá)(中等陽性和強(qiáng)陽性)。8例患者同時(shí)伴有BRG1和BRM蛋白低表達(dá)，且BRG1和BRM蛋白表達(dá)水平存在相關(guān)性(P= 0.013)，即兩者易發(fā)生同時(shí)表達(dá)降低(表2)。

2.3 BRG1、BRM表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系BRG1表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和組織學(xué)類型有關(guān) (P<0.05)。BRG1低表達(dá)組和高表達(dá)組遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽性率分別為51.5%(17/33)和31.8%(50/157)，

表1 三陰型乳腺癌的臨床病理特征

ABCD

表2 三陰型乳腺癌中BRG1與BRM蛋白表達(dá)的相關(guān)性

BRG1低表達(dá)組遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽性率約為高表達(dá)組的1.6倍，BRG1低表達(dá)的病例更有可能伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。TNBC中特殊類型乳腺癌和非特殊類型(浸潤性導(dǎo)管癌)BRG1低表達(dá)率分別為50.0%和16.2%，特殊類型乳腺癌相對于非特殊類型(浸潤性導(dǎo)管癌)來說更易出現(xiàn)BRG1低表達(dá)。BRG1蛋白表達(dá)水平與TNBC患者的發(fā)病年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、p53表達(dá)、基底樣亞型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。BRM蛋白表達(dá)水平與TNBC臨床病理特征均無相關(guān)性(表3)。

2.4 BRG1、BRM表達(dá)與TNBC預(yù)后的關(guān)系197例TNBC中， BRG1低表達(dá)組病死率為42.4%(14/33)，明顯高于BRG1高表達(dá)組[25%(40/160)]；BRM低表達(dá)組與高表達(dá)組病死率基本持平(28.6%vs27.9%)。Kaplan-Meier生存分析顯示，BRG1高表達(dá)與TNBC患者更好的預(yù)后相關(guān)，OS(P= 0.018)與PFS(P= 0.031)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而BRM蛋白表達(dá)水平對TNBC患者預(yù)后影響較小(圖2)。Cox單因素分析表明，BRG1低表達(dá)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與OS顯著相關(guān)(表4)。BRG1高表達(dá)與患者較好的預(yù)后相關(guān)(OS：HR=0.486，95%CI: 0.263～0.897,P= 0.021；PFS：HR= 0.572, 95%CI: 0.342～0.958,P=0.034)。Cox多因素分析納入BRG1表達(dá)、發(fā)病年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和基底樣亞型時(shí)，BRG1可作為OS的獨(dú)立預(yù)后保護(hù)性標(biāo)志物(HR= 0.479, 95%CI: 0.247～0.930,P= 0.030)。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是OS和PFS較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.001，表5)。

表3 三陰型乳腺癌中BRG1、BRM表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

近年SWI/SNF復(fù)合體由于編碼亞基高突變頻率而備受關(guān)注，BRG1是SWI/SNF復(fù)合物最常發(fā)生突變的亞基之一。迄今為止，研究已證實(shí)BRG1在多種腫瘤中起抑癌作用，如高鈣血癥型卵巢小細(xì)胞癌[2]和非小細(xì)胞肺癌[4]。本組數(shù)據(jù)支持BRG1在TNBC中具有抑癌基因作用，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致。然而，也有一些研究支持BRG1具有致癌作用。李青等[5]發(fā)現(xiàn)在胃癌中BRG1高表達(dá)與不良預(yù)后參數(shù)相關(guān)。造成這種差異的主要原因是不同的腫瘤類型有各自獨(dú)特的信號通路及發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

表4 三陰型乳腺癌患者預(yù)后的Cox單因素生存分析

表5 三陰型乳腺癌患者預(yù)后的Cox多因素生存分析

圖2 三陰型乳腺癌患者Kaplan-Meier生存分析，Log-rank檢驗(yàn)：A.BRG1高表達(dá)患者的總生存期(P=0.018)；B.BRG1高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期 (P=0.031)； C.BRM高表達(dá)患者的總生存期(P= 0.916)；D.BRM高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期(P=0.733)

目前，BRG1和BRM在TNBC中的作用尚不明確，相關(guān)研究也非常有限。本實(shí)驗(yàn)是評估BRG1和BRM表達(dá)與TNBC臨床病理特征關(guān)系及對預(yù)后影響的首個(gè)大規(guī)模隊(duì)列研究?，F(xiàn)階段僅有兩項(xiàng)研究專門對BRG1在乳腺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，兩項(xiàng)研究結(jié)果均支持BRG1具有促癌作用[6-7]。本組實(shí)驗(yàn)顯示在TNBC中BRG1低表達(dá)組患者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，BRG1高表達(dá)組患者的生存狀態(tài)優(yōu)于BRG1低表達(dá)組，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一致，可能是由于腫瘤異質(zhì)性引起。乳腺癌中不同的分子亞型其分子特征、信號通路及預(yù)后方面往往存在非常大的差異。以上兩項(xiàng)研究均缺乏對乳腺癌特定分子亞型的分析，且大部分為激素陽性乳腺癌。值得一提的是，Do等[6]研究隊(duì)列中包含30例TNBC，60%的TNBC病例被評定為BRG1低表達(dá)，且TNBC組BRG1低表達(dá)率明顯高于其它亞型，但該研究未作進(jìn)一步分析。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道BRG1在TNBC細(xì)胞系中具有促癌基因作用。然而最新研究表明，乳腺癌細(xì)胞系尤其是MDA-MB-231，該細(xì)胞系在上述研究中被廣泛當(dāng)作TNBC代表細(xì)胞系，實(shí)際上與基底樣轉(zhuǎn)移性乳腺癌樣本的基因表達(dá)譜和轉(zhuǎn)錄組均有非常顯著的不同[8]。因此，以上研究結(jié)論的可靠性仍需進(jìn)一步商榷。另外，本組還發(fā)現(xiàn)BRG1表達(dá)水平與BRM之間具有相關(guān)性，兩者易同時(shí)發(fā)生表達(dá)降低，與在卵巢癌[2]和肺癌[4]等腫瘤中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致。

早期實(shí)驗(yàn)表明BRG1純合突變在胚胎發(fā)育過程中會導(dǎo)致小鼠死亡，雜合突變會增加小鼠乳腺腫瘤的易感性[9]。機(jī)制上尚有證據(jù)支持，BRG1可以與RB基因協(xié)同作用，誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞形成扁平樣、生長受阻的細(xì)胞而發(fā)揮抑癌活性[10]。此外，BRG1蛋白是p53驅(qū)動轉(zhuǎn)錄激活所必需的一個(gè)元素，干擾BRG1表達(dá)將顯著抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制和凋亡[11]。BRG1也可直接與BRCA1相互作用，BRG1陰性突變或BRCA1 11號外顯子的致癌缺失性突變均會導(dǎo)致p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活功能的完全消除[12]。本組BRG1與p53表達(dá)的差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但BRG1高表達(dá)與p53陽性率之間存在一定相關(guān)性(P= 0.079)。此外，在正常培養(yǎng)的人乳腺上皮(human mammary epithelial, HME)細(xì)胞中，需要BRG1、FANCD2和BRCA1三者共同作用維持HME細(xì)胞分化的穩(wěn)定性，任何一方的缺失均將導(dǎo)致HME細(xì)胞發(fā)生自發(fā)的上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和異常分化[13]。眾所周知，BRCA1可以抑制惡性腫瘤的發(fā)生，在調(diào)節(jié)人類細(xì)胞的復(fù)制、修復(fù)遺傳物質(zhì)引起DNA損傷和維持細(xì)胞的正常生長等發(fā)揮重要作用。攜帶BRCA1突變的家族往往有較高的乳腺癌發(fā)病率，而且大多數(shù)由BRCA1突變介導(dǎo)的乳腺癌是TNBC。TNBC也常伴有Tp53突變(84%)和RB1突變/缺失(20%)[14]。鑒于BRG1與上述RB/p53/BRCA1抑癌基因蛋白有緊密的協(xié)作關(guān)系，因此BRG1可能在TNBC中發(fā)揮類似于RB1、p53或BRCA1抑癌基因的作用。此外，BRG1基因所在位置與19p13.2相對應(yīng)，19p13.2～13.3等位基因丟失是乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的常見事件，該位置常涉及多個(gè)預(yù)防乳腺癌和其它癌癥的腫瘤抑癌基因[15]。這些證據(jù)均非常有力地指向BRG1應(yīng)該在乳腺癌中具有抑癌基因的作用。然而，本實(shí)驗(yàn)無法獲取配對的TNBC病例中BRCA1和RB1狀態(tài)的信息，未來尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析其在匹配的臨床樣本中的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)還存在其它一些不足，例如個(gè)別病例臨床數(shù)據(jù)不完整；因蠟塊損耗和資金有限，不能對病例的全部乳腺癌組織進(jìn)行檢測等。