劉 剛，杜 華，蘇秀蘭

胃癌是一種具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其發(fā)病機制主要與遺傳物質(zhì)改變、幽門螺桿菌及EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染及表觀遺傳學(xué)改變相關(guān)[1-3]。目前，手術(shù)切除后輔以化療是胃癌患者常規(guī)治療手段之一，一系列化療藥物和分子靶向藥物，如奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶及赫賽汀等[4-6]提高胃癌患者的臨床治療效果，但由于其普遍存在藥物毒/副作用，胃癌患者的預(yù)后水平仍不容樂觀[7]。因此，有必要尋找新的胃癌分子治療靶點并探討其與胃癌預(yù)后的相關(guān)性，進一步優(yōu)化胃癌患者的精準治療。

CKS是周期蛋白依賴性激酶亞家族的成員之一，定位于人染色體9q22.2的CKS2基因的表達水平與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-13]。在癌癥發(fā)生過程中，CKS2可以調(diào)節(jié)CDK1-Cyclin B復(fù)合體的活性，從而參與細胞周期的調(diào)控以及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等多個過程[14]，但該蛋白與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系仍有待進一步分析。本文擬通過觀察CKS2蛋白在胃癌組織中的表達，探討其與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，綜合生物信息學(xué)的分析結(jié)果，明確CKS2作為胃癌患者獨立的預(yù)后因素和分子治療靶點的潛能。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013～2014年內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的203例胃癌石蠟標本及其相對應(yīng)的癌旁組織標本，其中男性138例，女性65例；年齡32～80歲；管狀腺癌122例，乳頭狀腺癌16例，低黏附性腺癌53例，黏液腺癌12例；Lauren分型：腸型腺癌38例，彌漫型腺癌108例，混合型腺癌57例；根據(jù)第7版AJCC胃癌TNM分期標準對胃癌標本進行TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期者63例，Ⅲ+Ⅳ期者140例。另隨機收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的新鮮胃癌組織及對應(yīng)的癌旁組織標本各30例；本實驗所有納入的胃癌患者，術(shù)前均未行任何放、化療或免疫治療，均有完整的臨床資料及隨訪資料。

1.2 試劑Trizol、qRT-PCR等分子類試劑均購自大連Takara公司；CKS2抗體購自武漢Proteintech公司；二抗及DAB顯色液購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 分別取100 mg液氮中保存的胃癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織，利用Trizol法分別提取其RNA，并利用全波長酶標儀測定其濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑誗YBRGreen試劑盒說明書，在Pikoreal儀中進行后續(xù)的qRT-PCR分析。CKS2基因引物序列如下：上游5′-TTCGACGAACA CTACGAGTACC-3′，下游5′-GGACACCAAGTCTCCT CCAC-3′，內(nèi)參GAPDH基因引物序列如下：上游5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，下游5′-GCTTCACCA CCTTCTTGATG-3′。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min、95 ℃ 2 min、60 ℃ 20 min、70 ℃ 10 s，合計40個循環(huán)，反應(yīng)完成后分析熔解曲線，每個組織樣本設(shè)置3個復(fù)孔，按2-ΔΔCt法計算基因表達水平。

1.3.2免疫組化 將收集的病理組織標本4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水，利用pH 9.0的EDTA高壓鍋修復(fù)，自然冷卻后行免疫組化EnVision法染色，采用陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷免疫組化染色結(jié)果分析由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。在顯微鏡高倍鏡下(400×)隨機選擇4個視野，分別計數(shù)視野內(nèi)的100個細胞，記錄抗體染色強度及陽性細胞百分比。按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，黃色為1分，淺棕色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比計分：1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；兩者相乘結(jié)果作為CKS2蛋白染色的最終評分，即≤6分為無或低表達，>7分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法利用GEPIA數(shù)據(jù)庫綜合分析不同癌癥組織中的CKS2蛋白表達水平；通過UALCAN數(shù)據(jù)庫挖掘CKS2蛋白表達水平與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性；采用GEPIA數(shù)據(jù)庫對比胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與CCNB1、CCNA2及CDK1蛋白表達的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；新鮮胃癌組織及癌旁組織中CKS2 基因的表達水平采用Wilcoxon signed-rink非參數(shù)檢驗進行分析；CKS2蛋白表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性則采用Pearson χ2進行分析；采用Kaplan-Meier和Log-rank分析患者生存曲線；采用多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型對有統(tǒng)計學(xué)意義的各臨床病理參數(shù)的關(guān)系進行分析說明；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中CKS2基因的表達采用qRT-PCR法檢測新鮮胃癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中CKS2基因的表達水平，實驗結(jié)果表明胃癌組織中CKS2基因的表達水平(0.97±0.16)高于癌旁組織(0.38±0.11，P<0.05，圖1)。

2.2 胃癌中CKS2蛋白表達與臨床病理特征的相關(guān)性在胃癌組織中CKS2蛋白高表達(121/203，59.60%)于細胞核中，而癌旁組織中CKS2蛋白呈低表達(82/203，40.40%)(圖2)。在胃癌組織中，CKS2蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.822，P=0.003)、腫瘤浸潤程度(χ2=6.991，P=0.008)、Lauren分型(χ2=18.363，P<0.001)及TNM分期(χ2=7.990，P=0.005)相關(guān)；與患者性別、年齡、HER-2表達、MSI狀態(tài)、EBV感染以及組織學(xué)類型無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 胃癌及癌旁組織中CKS2基因表達水平：與癌旁組相比，*P<0.05

ABCD

2.3 胃癌患者預(yù)后的生存分析進一步利用單因素Cox風(fēng)險回歸模型分析胃癌患者的預(yù)后水平，實驗結(jié)果表明，CKS2蛋白表達水平(P=0.002)、腫瘤浸潤深度(P=0.012)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)以及TNM分期(P<0.001)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)(表2)。采用多變量Cox風(fēng)險回歸模型分析胃癌患者的預(yù)后水平，分析結(jié)果顯示CKS2蛋白表達水平(P=0.015)以及TNM分期(P=0.001)是胃癌患者5年總生存率低的獨立危險因素。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，胃癌中CKS2蛋白高表達患者的5年生存率低于低或無CKS2蛋白表達患者(P<0.05)；與TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者相比，Ⅲ+Ⅳ期患者的5年生存率降低(P<0.05，圖3)。

表1 胃癌中CKS2蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 生物信息學(xué)分析GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，在腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、子宮頸鱗癌、結(jié)腸腺癌、彌漫大B細胞淋巴瘤、食管癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤以及頭頸鱗癌等腫瘤組織中，CKS2蛋白表達水平均高于其對應(yīng)正常組織(P<0.05，圖4)。

UALCAN數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，在胃癌組織中CKS2蛋白表達水平高于癌旁組織(P<0.05)，其表達水平與腫瘤分期及幽門螺桿菌感染無關(guān)(P>0.05，圖5)。數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果亦表明女性胃癌患者腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平高于男性患者(P<0.05)；不同年齡胃癌患者的腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平差異無顯著性(P>0.05)，年輕胃癌患者(21～40歲)腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平與癌旁組織中的表達水平差異無顯著性(P>0.05)。

表2 胃腺癌患者預(yù)后因素的Cox風(fēng)險回歸模型分析

圖3 胃癌患者的5年生存曲線分析：A.CKS2表達水平與胃癌患者5年生存率的相關(guān)性分析；B.TNM分期與胃癌患者5年生存率的相關(guān)性分析

圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫中CKS2蛋白表達水平：癌為癌組織；正為癌旁正常組織

圖5 胃癌組織(TCGA樣本)中CKS2表達與臨床病理特征的相關(guān)性：A.CKS2表達與胃癌發(fā)生的相關(guān)性，與正常組比較，*P<0.05；B.CKS2表達與胃癌分期的相關(guān)性，與正常組比較，*P<0.05；C.CKS2表達與胃癌患者性別的相關(guān)性，與正常組比較，*P<0.05；D.CKS2表達與胃癌患者年齡的相關(guān)性，與正常組比較，*P<0.05；與21～40歲組比較，#P<0.05；E.CKS2表達與胃癌腫瘤分級的相關(guān)性，與正常組比較，*P<0.05；與1級組比較，#P<0.05；F.CKS2表達與幽門螺旋菌感染的相關(guān)性；與正常組比較，*P<0.05

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，胃癌組織中的CKS2蛋白表達水平與CCNB1、CCNA2以及CDK1蛋白表達水平相關(guān)。進一步的實驗結(jié)果表明CKS2可能參與胃癌發(fā)生、發(fā)展中細胞周期調(diào)控過程(圖6)。

圖6 胃癌組織中CKS2蛋白與CCNB1(A)、CCNA2(B)及CDK1(C)蛋白表達水平的相關(guān)性

3 討論

在哺乳動物中，細胞周期蛋白激酶亞單位家族有2個成員，即CKS1和CKS2，均由79個氨基酸組成，其蛋白序列具有81%的同源性。該基因家族由Richardson等[15]于1990年首次克隆，進一步證明人CKS1位于第8q21號染色體，而CKS2基因位于第9q22號染色體。研究表明，CKS1和CKS2均參與細胞增殖的調(diào)控，作為SCFSkp2介導(dǎo)p27泛素化降解過程的所需成分，CKS1主要參與調(diào)控細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，而CKS2對細胞周期G2/M的轉(zhuǎn)換至關(guān)重要[16-17]。

CKS家族成員與癌癥發(fā)生過程密切相關(guān)，在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和腎癌等多種腫瘤組織中CKS1蛋白表達水平增加，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[18]，且在結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌和肝癌等多種腫瘤組織中CKS2蛋白表達水平增加[19]，與本組GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致。

為了證實CKS2表達水平與胃癌發(fā)生的相關(guān)性，本組實驗檢測了CKS2基因在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，與文獻報道[20]結(jié)果一致。為了進一步驗證CKS2表達水平與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性，本組擴大了納入的胃癌病例數(shù)，并利用免疫組化染色進一步證實胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型以及TNM分期密切相關(guān)。分析胃癌患者的預(yù)后，實驗結(jié)果表明CKS2蛋白高表達水平的胃癌患者5年生存時間低于CKS2蛋白低表達或不表達的胃癌患者，最終證實CKS2蛋白過表達提示胃癌患者的死亡風(fēng)險較高。

雖然本組免疫組化染色結(jié)果表明胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與患者年齡、性別無關(guān)，但UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，胃癌組織中CKS2蛋白表達水平與患者性別密切相關(guān)，因此需要進一步擴大樣本范圍以明確CKS2蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理的相關(guān)性，本組生物信息學(xué)結(jié)果表明在胃癌組織中，CKS2蛋白表達水平與CCNB1、CCNA2及CDK1蛋白表達密切相關(guān)，但CKS2蛋白與胃癌細胞增殖、細胞周期轉(zhuǎn)換之間的調(diào)控機制尚待進一步分析，未來的研究應(yīng)進一步明確上述潛在的調(diào)控機制，以確定CKS2蛋白在胃癌治療中的靶向應(yīng)用。