郭天威，張 閩，劉志菊，郭凌川，段衛(wèi)明，季月霞，曹 磊

目前，胃癌是全球發(fā)病率位居第4位、病死率位居第2位的惡性腫瘤[1]。胃癌治療以手術(shù)為主，聯(lián)合放、化療等綜合治療。近年精準(zhǔn)靶向治療越來(lái)越引起專(zhuān)家和學(xué)者的重視，免疫治療已成為胃癌治療的研究熱點(diǎn)。已有研究證實(shí)FOXP3、CTLA-4、PD-L1、B7-H3等免疫分子的表達(dá)與胃癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，改變免疫分子的表達(dá)水平可以干擾胃癌的發(fā)展[2]。

FOXP3是叉頭蛋白家族成員之一，是一種對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞形成及其免疫抑制功能起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[3]。FOXP3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，但Treg細(xì)胞在功能和表型呈多樣性[4-5]，腫瘤微環(huán)境中FOXP3+T細(xì)胞存在多種表型異質(zhì)性，在不同腫瘤中的FOXP3表達(dá)以及發(fā)揮的功能可能不同。因此，探討胃癌組織中不同部位的FOXP3表達(dá)與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2009～2011年蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)病理確診為胃腺癌的患者268例。制作組織芯片，芯片中每個(gè)標(biāo)本取2個(gè)點(diǎn)，癌周和癌巢各取1點(diǎn)。268例患者中有隨訪資料的198例，失訪70例。

1.2 主要試劑兔抗人單克隆抗體FOXP3(濃度稀釋比1 ∶400，克隆號(hào)1054C，R&D Systems公司)；鼠抗人單克隆抗體CD4(克隆號(hào)UMAB64，北京中杉金橋公司)。HRP標(biāo)記鼠/兔通用型二抗(即用型，福州邁新公司)；綠熒光染料(fluorescein System，PerkinElmer，USA)；紅熒光染料(Cyanine 3 System，PerkinElmer，USA)；應(yīng)用免疫組化EnVision法染色。

1.3 主要儀器Dmetrix遠(yuǎn)程醫(yī)療圖像處理系統(tǒng)、全自動(dòng)免疫組化檢測(cè)儀(羅氏公司)，全自動(dòng)多功能染色機(jī)(ST5020，徠卡公司)，全自動(dòng)封閉式脫水機(jī)(TSJ-Q，常州中威公司)，全自動(dòng)封片機(jī)(CV5030，徠卡公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.4 免疫組化檢測(cè)(1)將包埋制作好的組織芯片蠟塊切成3～5 μm薄片，黏附至防脫片；(2)65 ℃烘片1 h，置于二甲苯中10 min×2次；(3)經(jīng)無(wú)水乙醇清洗5 min×2次，90%、80%、70%梯度乙醇清洗，ddH2O各5 min；(4)檸檬酸緩沖液(1 L，pH 6.0)置于高壓鍋煮沸，玻片放入高壓鍋煮沸3 min，自然冷卻；(5)ddH2O洗3次，每次5 min；(6)室溫3%H2O2溶液浸泡15 min；(7)PBS(pH 7.2)緩沖液浸泡3次，每次5 min；(8)加封閉液濕盒內(nèi)37 ℃封閉1 h；(9)PBS 緩沖液浸泡3次，每次5 min；(10)加一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜；(11)再次PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(12)加二抗，室溫孵育1 h；(13)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(14)DAB顯色；(15)ddH2O漂洗5 min，蘇木精襯染后自來(lái)水沖洗玻片；(16)65 ℃烤箱烘干，中性樹(shù)膠封固。

1.5 雙色免疫熒光檢測(cè)(1)步驟同1.4免疫組化檢測(cè)步驟前13步，其中第10步的一抗為FOXP3；(2)加熒光染料(綠熒光)，室溫避光10 min；(3)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(4)進(jìn)行第二次抗原修復(fù)；(5)加一抗CD4，37 ℃孵育1 h；(6)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(7)加二抗(HRP標(biāo)記鼠/兔通用型二抗)；(8)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(9)加熒光染料(紅熒光)，室溫避光10 min；(10)PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min；(11)加DAPI，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 結(jié)果判斷組織芯片經(jīng)免疫組化染色后，應(yīng)用Dmetrix掃描系統(tǒng)掃描成數(shù)字切片，由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。在低倍(100×)、高倍(400×)鏡下觀察癌周與癌巢部位染色強(qiáng)度，細(xì)胞核或胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性(FOXP3為細(xì)胞核著色，CD4為胞膜、胞質(zhì)著色)，均要進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分；其中，0～1分為低表達(dá)，2～3分為高表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Pearson χ2檢驗(yàn)分析胃癌的癌周與癌巢FOXP3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；用Pearson相關(guān)分析癌周與癌巢FOXP3與CD4表達(dá)的關(guān)系；運(yùn)用Kaplan-Meier作生存分析，兩組曲線之間的比較采用Log-rank檢驗(yàn)，用Cox回歸分析兩組FOXP3表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中FOXP3的表達(dá)本組HE染色示癌周浸潤(rùn)邊緣的免疫細(xì)胞聚集成片(圖1A)或線性排列(圖1B)；癌巢免疫細(xì)胞灶性聚集于腫瘤間質(zhì)內(nèi)(圖1C)或散點(diǎn)狀分布于腫瘤間質(zhì)中(圖1D)。免疫組化染色示FOXP3在胃癌組織中有癌周和癌巢兩種浸潤(rùn)表達(dá)方式，癌周表達(dá)以片狀聚集、線狀分布為主；癌巢表達(dá)以灶性聚集，散在、點(diǎn)狀分布為主。其中癌周免疫細(xì)胞片狀聚集處FOXP3高表達(dá)(圖1E)，線性分布處免疫細(xì)胞FOXP3低表達(dá)(圖1F)；癌巢免疫細(xì)胞小灶性聚集處FOXP3高表達(dá)(圖1G)，間質(zhì)散點(diǎn)狀分布處FOXP3低表達(dá)(圖1H)。

2.2 胃癌中FOXP3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系FOXP3在癌周表達(dá)與患者死亡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)；FOXP3在癌周低表達(dá)患者中病死率更高(99.2%vs37.9%)，與其它臨床病理特征(患者年齡、性別、分化程度、腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、死亡等)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與癌周表達(dá)不同，F(xiàn)OXP3在癌巢的表達(dá)與腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，P=0.043)；癌巢FOXP3低表達(dá)的病例中更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時(shí)腫瘤最大徑超過(guò)5 cm的患者更多，與其它臨床病理特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 胃癌中FOXP3在癌周和癌巢表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Kaplan-Meier生存分析FOXP3在癌周表達(dá)的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：癌周FOXP3表達(dá)與患者生存呈正相關(guān)(P=0.02)，即低表達(dá)的患者具有更差的生存期。癌巢FOXP3表達(dá)與患者生存無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.625，圖2)。

ABCDEFGH

圖2 FOXP3在癌周和癌巢表達(dá)與患者生存分析：A.癌周FOXP3表達(dá)患者術(shù)后生存曲線；B.癌巢FOXP3表達(dá)的患者術(shù)后生存曲線

2.4 Cox單因素與多因素分析Cox單因素分析顯示癌周FOXP3表達(dá)有降低死亡風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(shì)(HR=0.637，P=0.022)。Cox多因素分析顯示腫瘤分期升高有死亡風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(shì)(HR=2.162，P<0.001)；癌周FOXP3表達(dá)具有降低死亡風(fēng)險(xiǎn)趨勢(shì)(HR=0.665，P=0.043，表2)。

表2 Cox單因素與多因素分析

2.5 不同部位FOXP3表達(dá)與CD4表達(dá)的相關(guān)性FOXP3與CD4的表達(dá)相關(guān)性分析顯示，癌周表達(dá)的FOXP3與CD4的表達(dá)之間存在顯著的正相關(guān)性(P=0.001)，而癌巢FOXP3表達(dá)和CD4表達(dá)之間無(wú)顯著相關(guān)性(表3)。

表3 癌周與癌巢中FOXP3的表達(dá)與CD4的相關(guān)性

2.6 不同部位FOXP3表達(dá)與CD4免疫熒光共定位分析利用雙色免疫熒光的方法檢測(cè)癌周的FOXP3和CD4共表達(dá)，結(jié)果顯示癌周表達(dá)的FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞有45%±18.8%表達(dá)CD4(圖3)，而癌巢表達(dá)的FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞僅有18.5%±7.6%表達(dá)CD4(圖4)。

3 討論

FOXP3被認(rèn)為是Treg細(xì)胞最特異的生物學(xué)標(biāo)記，在其分化、維持及免疫抑制功能方面起至關(guān)重要的作用[6]。Treg在機(jī)體的腫瘤免疫中主要發(fā)揮免疫抑制作用, 在免疫應(yīng)答中經(jīng)過(guò)TCR介導(dǎo)的信號(hào)刺激后能抑制B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FOXP3+T細(xì)胞存在高度異質(zhì)性，其在不同的腫瘤、不同部位及不同細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)揮迥異的免疫功能。多數(shù)研究顯示FOXP3+細(xì)胞和Treg相關(guān)，提示患者預(yù)后不良[7]。Nakayama等[8]在非特指性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的研究顯示，腫瘤內(nèi)FOXP3+Treg細(xì)胞提示預(yù)后更差，O’Callaghan等[9]的研究顯示非小細(xì)胞肺癌中局灶浸潤(rùn)FOXP3+T細(xì)胞提示預(yù)后不良，沈吟芳等[10]研究同樣顯示肺癌微環(huán)境中FOXP3+Treg參與肺癌的進(jìn)展和免疫逃逸。但也有多項(xiàng)研究顯示FOXP3高表達(dá)患者具有更好的預(yù)后，Yeong等[11]在164例乳腺癌中的研究顯示，腫瘤內(nèi)存在高密度FOXP3+Treg的患者總生存期和無(wú)瘤生存期明顯更長(zhǎng)。另一項(xiàng)乳腺癌的研究顯示，高密度FOXP3+腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)浸潤(rùn)與ER-乳腺癌的良好預(yù)后相關(guān)[12]。此外，研究顯示Ⅰ+Ⅱ期的結(jié)直腸癌中FOXP3+的T細(xì)胞高密度浸潤(rùn)均與良好的預(yù)后相關(guān)[13-14]。鄭珂等[15]在EBV相關(guān)性胃癌中的研究結(jié)果示FOXP3+和CD8+淋巴細(xì)胞高浸潤(rùn)組比低浸潤(rùn)組腫瘤浸潤(rùn)深度淺，脈管內(nèi)癌栓形成率較低，5年生存率高，提示患者預(yù)后良好。同一類(lèi)腫瘤不同部位FOXP3+TIL存在功能異質(zhì)性：乳腺癌癌周FOXP3+TIL降低是化療后病理完全緩解的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，而癌巢內(nèi)FOXP3+TIL在化療后與患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)[16]。上述研究結(jié)果提示不同部位FOXP3的表達(dá)對(duì)臨床腫瘤患者的病理特征、預(yù)后等指標(biāo)的影響也不同。

③A③B③C③D④A④B④C④D

FOXP3不僅在TIL表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中也表達(dá)，并且在癌細(xì)胞核內(nèi)和胞質(zhì)的表達(dá)功能不同，F(xiàn)OXP3在細(xì)胞核的表達(dá)是改善乳腺癌總生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，而FOXP3在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)意義尚未明確[17]。BT549乳腺癌細(xì)胞系中的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3可以通過(guò)直接與啟動(dòng)子結(jié)合抑制SATB1基因表達(dá)或是通過(guò)產(chǎn)生2個(gè)miRs(miR-7及miR-155)來(lái)沉默該基因[18]。這些研究均提示FOXP3在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起抑制作用。另一些研究顯示早期胃癌腫瘤細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān)，同樣提示FOXP3的抑癌作用[19]。Won等[20]的研究顯示腫瘤細(xì)胞FOXP3的表達(dá)與胃癌患者良好預(yù)后相關(guān)，其途徑是通過(guò)增加腫瘤抑制蛋白p21的表達(dá)。這些腫瘤細(xì)胞中的信號(hào)分子可能也在免疫細(xì)胞中起作用，可能是FOXP3抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。

TIL是腫瘤組織中浸潤(rùn)的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等一組異質(zhì)性的細(xì)胞群。CD4+T細(xì)胞在多種腫瘤中被認(rèn)為和預(yù)后良好相關(guān)，但在胃癌中其對(duì)患者預(yù)后的影響有不同結(jié)論，這取決于其亞型的功能[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示癌周FOXP3表達(dá)與腫瘤組織浸潤(rùn)的CD4表達(dá)呈顯著正相關(guān)，同時(shí)研究顯示CD4陽(yáng)性細(xì)胞和患者的生存期呈顯著正相關(guān)(P=0.004)；提示此研究條件下胃癌組織中CD4的表達(dá)可能為抑制腫瘤的效果，與FOXP3之間可能存在一定聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙色免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了癌周表達(dá)的FOXP3與CD4的共表達(dá)情況，提示癌周FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞有較高比例CD4+/FOXP3+免疫細(xì)胞，但無(wú)法確認(rèn)是否為T(mén)reg細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證CD4/FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞亞型。因此，胃癌組織中癌周的FOXP3+/CD4+仍不足以代表具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞?？赡馨┙M織內(nèi)不同部位的FOXP3+細(xì)胞具有不同的免疫表型甚至發(fā)揮不同的功能，對(duì)這類(lèi)FOXP3+細(xì)胞的深入研究仍有較大的價(jià)值。

雖然癌巢內(nèi)FOXP3的表達(dá)和患者的生存期無(wú)顯著相關(guān)性，但與癌周表達(dá)不同，F(xiàn)OXP3在癌巢的表達(dá)與腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，P=0.043)；尤其與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癌巢FOXP3高表達(dá)的病例中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更少，提示臨床分期更低，這與Lee等[22]的研究結(jié)論相似。癌巢FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)CD4更低，與癌周FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞有較大差異，進(jìn)一步分析顯示FOXP3陽(yáng)性細(xì)胞的不同亞群對(duì)FOXP3在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中的功能有重大意義。