高 蘭，龍世棋，陳博鑫，章 俊

氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)是貫穿腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的獨(dú)立病因，表現(xiàn)為胞內(nèi)異常增多的活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS)堆積；造成細(xì)胞的OS損傷、OS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖以及抗瘤治療的不敏感等[1]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSC)是腫瘤細(xì)胞的重要亞群，其決定腫瘤的發(fā)生、自我更新、異質(zhì)性及可塑性[2]。研究發(fā)現(xiàn)OS與CSC的相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并誘導(dǎo)治療耐受。前期研究發(fā)現(xiàn)抗氧化六配位攜氧蛋白Cytoglobin(CYGB)在人肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織中的表達(dá)顯著降低[3]，補(bǔ)充CYGB通過下調(diào)胞內(nèi)OS水平降低HCC細(xì)胞的干細(xì)胞性[3]；提示靶向OS與CSC之間異常調(diào)控為治療腫瘤提供多個(gè)可能的有效新靶點(diǎn)。還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性氧化還原穩(wěn)態(tài)保護(hù)劑，抑制GSH的代謝能夠提高乳腺癌干細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[4]。外源性補(bǔ)充L-GSH能夠保護(hù)檳榔堿所致肝損害[5]。目前，GSH被研究或運(yùn)用于各種慢性炎癥、心血管疾病及惡性腫瘤等疾病的輔助治療，但與肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells, LCSC)的相互關(guān)系還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)著重探討外源性GSH對(duì)LCSC生長(zhǎng)及亞群分布的影響，評(píng)估其在肝癌治療的研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料收集人HCC細(xì)胞系HepG2、Huh7、SK-Hep1以及人正常肝細(xì)胞系LO2，用于本課題的研究。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1內(nèi)源性總谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(T-GSH/GSSG)含量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)分組 該實(shí)驗(yàn)分為3種HCC細(xì)胞組及正常肝細(xì)胞組，評(píng)價(jià)不同分組間內(nèi)源性GSH含量的差異，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次。

1.2.2外源性GSH對(duì)胞內(nèi)ROS水平作用的實(shí)驗(yàn)分組 3種HCC細(xì)胞分為對(duì)照組及GSH處理組，DCFH-DA活性熒光染料標(biāo)記、熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度、評(píng)估胞內(nèi)ROS水平，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次。

1.2.3外源性GSH對(duì)HCC細(xì)胞活力作用的實(shí)驗(yàn)分組 3種HCC細(xì)胞系分為對(duì)照組及GSH處理組，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次。

1.2.4肝癌干細(xì)胞球(HCC sphere)形成實(shí)驗(yàn)分組 將3種HCC細(xì)胞分為對(duì)照組及25、50、100 nmol/L的GSH處理組，流式分析CD133陽(yáng)性LCSC在HCC細(xì)胞中的比例。干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC sphere形成，并測(cè)量其大小和計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次。

1.3 T-GSH/GSSG的定量檢測(cè)將2 000個(gè)HCC細(xì)胞及正常肝細(xì)胞接種至避光96孔板中過夜貼壁后，使用胞內(nèi)T-GSH/GSSG測(cè)試盒(南京建成生物公司)測(cè)定內(nèi)源性GSH含量。檢測(cè)原理：使用比色法檢測(cè)樣品中巰基的含量；無色的5,5-二硫二硝基苯甲酸(DTNB)能夠被巰基化合物轉(zhuǎn)化為具有黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸，其在412 nm處具有最大吸收峰，使用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)試劑繪制比色值(412 nm Absorbance，X軸)與GSH濃度(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算轉(zhuǎn)換公式，根據(jù)公式計(jì)算樣本中實(shí)際GSH的濃度。

1.4 OS的誘導(dǎo)及胞內(nèi)ROS含量的檢測(cè)將足量HCC細(xì)胞接種至96孔板中過夜貼壁，為了進(jìn)一步提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)OS水平，使用含20 μmol/L的H2O2培養(yǎng)基預(yù)處理HCC細(xì)胞30 min，PBS洗滌2次后，置換分別含有100 nmol/L的GSH或不含GSH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。使用10 μmol/L的DCFH-DA(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)活性熒光試劑(Sigma Aldrich公司)孵育30 min后，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度、評(píng)估胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA與胞內(nèi)ROS反應(yīng)后生成的熒光物質(zhì)7′-二氯熒光素(7′-Dichlorofluorescein, DCF)。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度，評(píng)估胞內(nèi)ROS水平。

1.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC細(xì)胞活力將2 000～4 000個(gè)HCC細(xì)胞接種至96孔板中，分別加入100 μL含有50 nmol/L的GSH或不含GSH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。加入10 μL的CCK-8試劑孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔溶液450 nm處的吸光度值。通過CCK-8檢測(cè)細(xì)胞線粒體脫氫酶活性，間接反映細(xì)胞活力(活細(xì)胞數(shù)量)。

1.6 HCC sphere的培養(yǎng)按每孔20 000個(gè)HCC細(xì)胞接種至24孔的低黏附性培養(yǎng)板(Ultra-low adherent plates，購(gòu)自美國(guó)康寧公司)中，使用含不同濃度GSH的CSC培養(yǎng)基(Mammo Cult Human Medium Kit，購(gòu)自Stemcell Technologies公司)體外培養(yǎng)HCC細(xì)胞6～8天，觀察孔內(nèi)HCC sphere的形成及生長(zhǎng)，顯微鏡下觀察及測(cè)量細(xì)胞球并對(duì)直徑>60 μm細(xì)胞球計(jì)數(shù)。

1.7 HCC干細(xì)胞性的誘導(dǎo)及亞群比例檢測(cè)為進(jìn)一步誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的干細(xì)胞性，本實(shí)驗(yàn)使用低血清培養(yǎng)基(2% FBS培養(yǎng)基)培養(yǎng)誘導(dǎo)CSC。CD133分子是LCSC膜表面的重要分子標(biāo)記。將含100 nmol/L的GSH低血清培養(yǎng)基處理48 h后HCC細(xì)胞收集，使用偶聯(lián)熒光素藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)的CD133熒光抗體孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞的百分比；流式結(jié)果使用二維圖示，設(shè)M2 gate(%)為CD133陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 HCC細(xì)胞中T-GSH/GSSG的含量肝臟是GSH合成的重要器官，其通過與GSSG的相互轉(zhuǎn)換，快速、高效的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。使用T-GSH/GSSG檢測(cè)試劑盒定量評(píng)估不同HCC細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞中內(nèi)源性GSH的含量。首先配置梯度濃度分別為0、5、10、20、50和100 μg/mL的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入胞內(nèi)GSH檢測(cè)試劑避光孵育30 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm處標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并換算濃度計(jì)數(shù)公式(圖1A)。同時(shí)測(cè)量正常肝細(xì)胞LO2，3種HCC細(xì)胞HepG2、SK-Hep1和Huh7中內(nèi)源性GSH的含量。結(jié)果顯示：T-GSH/GSSG在3種HCC細(xì)胞中的含量比正常肝細(xì)胞中的含量顯著增高(P<0.05，圖1B)，即HCC細(xì)胞中GSH合成及氧化增多，催化GSSG合成增加。因此，推測(cè)HCC細(xì)胞內(nèi)異常增多的ROS上調(diào)了胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡點(diǎn)，提高腫瘤細(xì)胞的抗氧化防御能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞拮抗OS損傷得以存活的能力。

2.2 外源性補(bǔ)充GSH對(duì)HCC細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞活力的影響GSH廣泛分布于人體各組織器官，是安全、無毒的內(nèi)源性寡肽物質(zhì)。已廣泛運(yùn)用于臨床對(duì)各種因素所致急性肝損傷的輔助治療。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞內(nèi)T-GSH/GSSG的含量顯著升高，氧化還原平衡點(diǎn)上調(diào)。因此補(bǔ)充GSH恢復(fù)及提高胞內(nèi)GSH的儲(chǔ)備，觀察其對(duì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞活力的影響。本實(shí)驗(yàn)使用20 μmol/L的H2O2預(yù)處理HCC細(xì)胞，誘導(dǎo)胞內(nèi)高水平OS。然后外源性導(dǎo)入100 nmol/L的GSH，檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GSH處理組中HCC細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05，圖2A)；提示外源性補(bǔ)充抗氧化劑GSH能夠減少胞內(nèi)異常堆積的ROS、下調(diào)HCC細(xì)胞內(nèi)異常升高的OS。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性補(bǔ)充GSH對(duì)HCC細(xì)胞活力的影響，將3種HCC細(xì)胞系分為對(duì)照組及GSH處理組(50 nmol/L)體外培養(yǎng)48 h，使用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性導(dǎo)入GSH與對(duì)照組相比顯著抑制HCC細(xì)胞活力(P<0.01，圖2B)；提示抗氧化劑GSH可能抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常ROS堆積誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

圖1 正常肝細(xì)胞及HCC細(xì)胞內(nèi)T-GSH/GSSG含量測(cè)定：A.繪制標(biāo)準(zhǔn)品GSH吸光度值(X軸)與標(biāo)準(zhǔn)濃度(Y軸)曲線并推算濃度計(jì)數(shù)公式；B.比較正常肝細(xì)胞(LO2)與不同HCC細(xì)胞(HepG2、Huh7和SK-Hep1)中內(nèi)源性T-GSH/GSSG含量的差異，*P<0.05

圖2 GSH對(duì)HCC細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞活力的作用：A.補(bǔ)充100 nmol/L的GSH對(duì)不同HCC 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響；B.補(bǔ)充50 nmol/L的GSH對(duì)不同HCC細(xì)胞活力的影響，*P<0.05，**P<0.01

2.3 外源性GSH不同濃度對(duì)LCSC生長(zhǎng)的影響體外培養(yǎng)的CSC在干細(xì)胞培養(yǎng)基中呈球形生長(zhǎng)，將3種HCC細(xì)胞系接種到干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)6～8天，觀察梯度濃度為0、25、50和100 nmol/L GSH對(duì)HCC sphere形成的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充不同濃度GSH均有效抑制了HCC sphere形成的體積及數(shù)量(圖3)。鏡下觀察加入GSH顯著抑制HCC sphere形成的大小，其中HepG2和SK-Hep1細(xì)胞系中GSH的100 nmol/L處理組與對(duì)照組及GSH的25 nmol/L及50 nmol/L組相比，進(jìn)一步抑制了HCC sphere形成的大小(P<0.05，圖4A)。HCC sphere計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，GSH顯著抑制HCC sphere形成的數(shù)量(P<0.05，圖4B)。值得注意的是，100 nmol/L的GSH處理HepG2及SK-Hep1細(xì)胞，HCC sphere形成的數(shù)量比25、50 nmol/L的GSH處理的數(shù)量增多，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)可能是由于100 nmol/L的GSH顯著干擾了HCC sphere形成，部分HCC sphere沒有很好的形成球形結(jié)構(gòu)，松散或解體造成HCC sphere的數(shù)量增多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一定濃度范圍內(nèi)補(bǔ)充抗氧化劑GSH能夠抑制LCSC的生長(zhǎng)。

2.4 外源性GSH對(duì)LCSC亞群分布的影響本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充GSH顯著抑制HCC sphere的生長(zhǎng)。進(jìn)一步探討補(bǔ)充GSH對(duì)LCSC在HCC細(xì)胞中亞群分布的影響，首先使用低血清(2% FBS)培養(yǎng)HCC細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤的干細(xì)胞性。使用CD133特異性熒光抗體標(biāo)記100 nmol/L的GSH處理后的不同HCC細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分析CD133+LCSC在總HCC細(xì)胞中的比例。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GSH處理后顯著減少CD133+LCSC在腫瘤細(xì)胞中的亞群比例(P<0.05，圖5)，提示外源性補(bǔ)充抗氧化劑GSH能夠降低CSC。

3 討論

GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的還原劑，其通過自身的合成、消耗及降解，與GSSG的相互轉(zhuǎn)換，快速、高效的調(diào)節(jié)并維持體內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。足量GSH儲(chǔ)備能夠拮抗ROS的異常堆積及細(xì)胞的OS損傷。研究證實(shí)GSH參與多種細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生命活動(dòng)的調(diào)控。GSH的缺乏或GSH/GSSG的比值下降導(dǎo)致細(xì)胞易于遭受OS損傷，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而提高GSH水平能夠增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力并拮抗腫瘤細(xì)胞中異常升高的OS[6]。深入研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者術(shù)前血清中GSH含量降低，且氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)水平比術(shù)后顯著升高，顯示機(jī)體總抗氧化能力當(dāng)量(trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC)降低。切除的肝癌組織中總GSH含量升高，且催化GSSG生成的GSH過氧化物酶(GPx)活性比癌旁組織顯著提高[7]。GSH過氧化酶2(GPx2)在肝癌組織中高表達(dá)，且表達(dá)水平與肝癌患者的甲胎蛋白水平、臨床分期以及不良預(yù)后呈正相關(guān)[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)GPx，GSH還原酶(GSR)及硫氧還蛋白等氧化還原反應(yīng)調(diào)控分子，提高腫瘤細(xì)胞的抗氧化防御能力，保護(hù)腫瘤拮抗不良微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T-GSH/GSSG在HCC細(xì)胞中的含量比正常肝細(xì)胞顯著升高，提示HCC細(xì)胞中GSH合成增多，并與胞內(nèi)多量的ROS反應(yīng)，生成GSSG增多?？傊?，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)高水平OS啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的異常代謝及功能、上調(diào)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡點(diǎn)、腫瘤細(xì)胞自身抗氧化防御能力增強(qiáng)，能夠拮抗不良微環(huán)境得以存活，促進(jìn)了腫瘤的演進(jìn)。

圖3 補(bǔ)充不同濃度GSH組處理不同HCC sphere形成大小及數(shù)量

圖4 補(bǔ)充不同濃度GSH對(duì)不同HCC sphere大小(A)及形成數(shù)量(B)的影響：不同濃度GSH處理組與對(duì)照組比較，*P<0.05；補(bǔ)充100 nmol/L的GSH處理組與25 nmol/L的GSH處理組比較，#P<0.05；補(bǔ)充100 nmol/L的GSH處理組與50 nmol/L GSH處理組比較，**P<0.05

圖5 不同濃度GSH對(duì)CD133+ LCSC亞群比例的影響：A.100 nmol/L的GSH處理不同HCC細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例，M1為無熒光標(biāo)記細(xì)胞的熒光本底面積，M2為熒光標(biāo)記后扣除本底增加的熒光面積；B.100 nmol/L的GSH處理不同HCC細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組比較，*P<0.05

GSH廣泛分布于人體各組織器官，是安全、無毒的內(nèi)源性三肽活性物質(zhì)。其表達(dá)調(diào)控除了受胞內(nèi)GSH水平的負(fù)反饋調(diào)控外，更重要的是依賴多種微環(huán)境刺激因素如ROS堆積等激活GSH合成限速酶-谷氨酰半胱氨酸合酶的高表達(dá)調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自身高表達(dá)GSH并不能拮抗腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。xCT基因通過調(diào)控半胱氨酸及谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)參與調(diào)控GSH的合成，RAS基因異常激活RAF/MAPK信號(hào)促進(jìn)xCT的表達(dá)，而敲除xCT表達(dá)抑制了由癌基因KRAS介導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)嫁接瘤的生長(zhǎng)，提示腫瘤細(xì)胞中GSH的穩(wěn)定表達(dá)，被癌基因RAS 介導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生所依賴[10]。OS能夠激活胞內(nèi)MAPK(ERK1/2和p38)及PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)提出外源性補(bǔ)充抗氧化劑GSH的貯備，下調(diào)腫瘤細(xì)胞中異常OS過度激活的細(xì)胞增殖信號(hào)，同時(shí)反饋抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性GSH異常表達(dá)的治療策略。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性補(bǔ)充足量GSH顯著抑制多種肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。一定程度上支持了本實(shí)驗(yàn)的設(shè)想，為使用外源性GSH靶向異常OS治療腫瘤提供理論依據(jù)。

CSC是腫瘤細(xì)胞的重要亞群，OS能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞性。CSC具有GSH依賴性抗氧化系統(tǒng)，加強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的OS防御能力并使之獲得相應(yīng)的干細(xì)胞表型[12]。文獻(xiàn)報(bào)道幾種外源性抗氧化劑的補(bǔ)充通過拮抗OS與CSC的相互作用，降低腫瘤的干細(xì)胞性及CSC的亞群比例，拮抗了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3,13-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析GSH對(duì)CSC生長(zhǎng)及分群的影響；結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為25～100 nmol/L的GSH顯著抑制HCC sphere的生長(zhǎng)。CD133分子是LCSC表面最廣泛分布的干細(xì)胞標(biāo)記[15]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充GSH同時(shí)降低CD133+LCSC在HCC細(xì)胞中的亞群比例。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)論證外源性補(bǔ)充足量GSH能夠靶向CSC并抑制HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，為靶向腫瘤異常OS及與CSC的不良作用治療腫瘤提供新的有效靶點(diǎn)和策略。最近研究報(bào)道內(nèi)源性GSH的清除協(xié)同產(chǎn)生ROS的治療提高了CSC對(duì)電離輻射治療的敏感性[16]。電離輻射又可誘導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞性的增強(qiáng)及癌基因的活化[17]；提示GSH在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜且多變，需積累更多病例進(jìn)一步分析。