鄒進(jìn)晶 查干 王有娜 索濤 吳小軍

哮喘是多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的一種慢性非特異性氣道炎癥性疾病[1-2]。既往研究結(jié)果顯示，輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)反應(yīng)失衡是哮喘免疫失衡的主要機(jī)制，然而其作用通路還不足以完全解釋哮喘患者癥狀的持續(xù)存在[3-4]。白藜蘆醇(RES)是植物在環(huán)境惡化及受到病原攻擊時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素。既往研究表明，RES在哮喘[5]、慢性阻塞性肺疾病[6]、急性肺損傷[7]及肺間質(zhì)性病變[8]等呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種晚期炎癥因子，已有研究證實(shí)其在維持哮喘氣道炎癥中發(fā)揮作用[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積和氣道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，參與哮喘的氣道重塑過程[10]。我們通過檢測RES對(duì)哮喘小鼠模型氣道炎癥反應(yīng)及肺組織HMGB1和MMP-9表達(dá)的影響，探討其影響哮喘氣道炎癥的機(jī)制，為支氣管哮喘患者的治療提供新思路和理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠36只，體重約20 g，購于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。雞卵清蛋白(OVA)購于Sigma公司；免疫組化一抗購于美國Gene Tex公司；二抗及顯色劑購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購于Transgene公司；Trizol總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生科有限公司；ECL發(fā)光液購于美國Thermo Scientific公司。實(shí)驗(yàn)儀器包括超聲霧化器、實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI7500型)、光學(xué)顯微鏡等。

2.方法

(1)動(dòng)物分組和哮喘小鼠模型制作：將36只C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組及RES干預(yù)組，每組各12只。哮喘小鼠模型制作：①致敏:于第1天、第14天予每只小鼠分別腹腔注射致敏液0.2 ml(1 mg/ml OVA 0.1 ml與10 mg/ml佐劑液態(tài)鋁0.1 ml混合制備)；②激發(fā):于第21～27天將小鼠置于密閉容器(20 cm×40 cm×50 cm)中，以10 mg/ml的OVA溶液10 ml霧化吸入，每天1次，每次30 min；同時(shí)，RES干預(yù)組小鼠于激發(fā)前1 h，采用100 mg/kg的RES腹腔注射進(jìn)行干預(yù)；對(duì)照組和哮喘組小鼠腹腔注射等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。末次激發(fā)24 h后處死動(dòng)物，進(jìn)行標(biāo)本采集。

(2)肺組織標(biāo)本制備：第28天斷椎處死各組小鼠，并立即予PBS進(jìn)行肺泡灌洗，收集1ml肺泡灌洗液于EP管中，迅速取新鮮右肺組織置于1.5 ml的EP管中，置于-80 ℃冰箱貯存。將取出的左肺組織置于4%甲醛溶液中，石蠟包埋固定切片后，行蘇木素-伊紅(HE)染色、過碘酸-雪夫(PAS)染色及免疫組化染色。

(3)HE染色、PAS染色及免疫組化染色：每只小鼠分別隨機(jī)選取3張肺組織石蠟切片行HE和PAS染色。評(píng)分方法：兩位獨(dú)立的觀察者在200倍顯微鏡下對(duì)支氣管壁炎癥細(xì)胞浸潤及杯狀細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行半定量評(píng)分，每張切片至少觀察4個(gè)視野，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：支氣管壁及血管周圍無炎癥細(xì)胞浸潤；1分：支氣管壁及血管周圍有散在炎癥細(xì)胞浸潤；2分：支氣管壁及血管周圍有1～5層炎癥細(xì)胞浸潤；3分：支氣管壁及血管周圍有>5層炎癥細(xì)胞浸潤。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析氣道上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量及基底膜周徑標(biāo)準(zhǔn)化的PAS+杯狀細(xì)胞面積(Apas+/Pbm)。每張石蠟切片也均進(jìn)行免疫組化染色，觀察炎癥細(xì)胞中HMGB1和MMP-9蛋白的表達(dá)，采用積分光密度(IOD)反映目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

(4)肺組織HMGB1和MMP-9 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測：采用Trizol法提取右肺組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，并設(shè)計(jì)目的基因引物。HMGB1序列上游引物:5’-AAAGAAGTTCAAGGACCCC-3’，下游引物:5’-GCTCTGTAGGCAGCAATAT-3’,產(chǎn)物長度234 bp；MMP-9序列上游引物:5’-GCGTGTCTGGAGATTCGACT-3’,下游引物:5’-TTTGGAAACTCACACGCCAG-3’，產(chǎn)物長度167 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’,下游引物:5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’，產(chǎn)物長度229 bp;PCR反應(yīng)體系(20 μl)：模板cDNA 4 μl，PCR上、下游引物(100 μM)各0.4 μl，預(yù)混緩沖液(SYBR Greenn/Flourescein qPCR Master)10 μl，雙蒸水(ddH2O)5.2 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次,記錄每次測定的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，得出的數(shù)據(jù)采用2-△△Ct進(jìn)行分析。

(5)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中HMGB1和MMP-9蛋白水平檢測：將保存在-80 ℃冰箱中的BALF取出，于冰上復(fù)融后在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測HMGB1和MMP-9蛋白水平。

結(jié) 果

1.3組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較：對(duì)照組小鼠肺組織HE染色下見支氣管結(jié)構(gòu)排列規(guī)律，未見炎癥胞浸潤(圖1A)；PAS染色下見支氣管上皮細(xì)胞中幾乎無杯狀細(xì)胞(PAS+細(xì)胞)和黏液分泌(圖1B)。哮喘組小鼠肺組織HE染色下見氣道壁明顯增厚，肺泡融合，支氣管壁和血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞為主(圖1C)；PAS染色下見支氣管上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞(PAS+細(xì)胞)增殖及黏液分泌明顯增多(圖1D)。與哮喘組比較,RES干預(yù)組小鼠肺組織HE染色下見氣道壁明顯變薄、肺泡融合明顯減少，支氣管壁和血管周圍炎癥細(xì)胞明顯減少(圖1E)；PAS染色下見支氣管上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞(PAS+細(xì)胞)數(shù)量和黏液分泌明顯減少(圖1F)。對(duì)照組、哮喘組和RES干預(yù)組小數(shù)肺組織炎癥病理學(xué)評(píng)分分別為0.33±0.18、2.68±0.39、1.51±0.54，Apas+/Pbm分別為0.41±0.44、6.01±1.28、3.54±1.59。RES干預(yù)組小鼠肺組織炎癥病理學(xué)評(píng)分和Apas+/Pbm均明顯低于哮喘組(P<0.05)。

2.3組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9蛋白免疫組化及mRNA檢測結(jié)果比較：對(duì)照組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)較少，而哮喘組小鼠肺組織中的表達(dá)明顯增多，但RES干預(yù)組HMGB1和MMP-9蛋白及mRNA的表達(dá)水平均明顯低于哮喘組(P<0.05)。見圖2和表1。

表1 3組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

3.3組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、HMGB1及MMP-9蛋白表達(dá)水平比較：哮喘組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、HMGB1及MMP-9表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)；RES干預(yù)組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、HMGB1及MMP-9表達(dá)水平均低于哮喘組(P<0.05)。見表2。

圖1 3組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較(×200，A:對(duì)照組，HE染色；B：對(duì)照組，PAS染色；C:哮喘組，HE染色；D:哮喘組，PAS染色；E：RES干預(yù)組，HE染色；F：RES干預(yù)組，PAS染色)

圖2 3組小鼠肺組織中HMGB1和MMP-9蛋白免疫組化結(jié)果(×200，A、D:對(duì)照組；B、E:哮喘組；C、F:RES干預(yù)組)

表2 3組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、HMGB1及MMP-9蛋白表達(dá)水平比較

討 論

既往研究結(jié)果顯示，RES可減輕慢性哮喘小鼠氣道炎癥，并改善其氣道重塑、降低氣道高反應(yīng)性、改善肺功能[11]。Lee等[12]的研究表明，RES干預(yù)哮喘小鼠模型組血清和BALF中Th2相關(guān)細(xì)胞因子分泌明顯減少，氣道炎癥細(xì)胞數(shù)量及氣道黏液分泌明顯減少。本研究結(jié)果顯示，與哮喘組比較，RES干預(yù)組小鼠支氣管壁明顯變薄，支氣管壁及血管周圍炎癥細(xì)胞也明顯減少，BALF中炎癥細(xì)胞、支氣管上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量及分泌的黏液也明顯減少。因此，從肺組織炎癥病理學(xué)評(píng)分和Apas+/Pbm角度而言，RES明顯減輕哮喘小鼠氣道炎癥，但其具體機(jī)制尚未明確。

HMGB1廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)被激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的HMGB1釋放到細(xì)胞外[13]。Ma等[14]的研究表明，細(xì)胞外HMGB1參與Th2為主導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)哮喘小鼠模型BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)細(xì)胞外HMGB1水平與哮喘的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且該研究還認(rèn)為HMGB1是激素抵抗型哮喘的潛在病因之一。Hou等[15]的研究也表明，哮喘患者肺活檢標(biāo)本及誘導(dǎo)痰液中HMGB1水平明顯升高，且與BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，與肺功能呈負(fù)相關(guān)。有研究表明，給予抗HMGB1功能性抗體干預(yù)后哮喘小鼠模型HMGB1的表達(dá)明顯減少，哮喘癥狀明顯減輕[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘組小鼠BALF中HMGB1蛋白及肺組織中HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高；而RES干預(yù)組小鼠BALF中HMGB1蛋白及肺組織中HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯低于哮喘組。因此，我們推測RES可能通過降低HMGB1的表達(dá)抑制哮喘氣道炎癥的發(fā)生。

MMP-9是與哮喘氣道重塑關(guān)系最密切的MMPs成員。Royce等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，RES可通過抑制上皮下膠原沉積減輕慢性哮喘小鼠氣道重塑。本研究結(jié)果顯示，與哮喘組比較，RES干預(yù)組小鼠BALF中MMP-9蛋白及肺組織中MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯低于哮喘組。因此，我們推測RES可能通過調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)抑制哮喘小鼠氣道重塑。

綜上所述，RES可減輕哮喘小鼠氣道炎癥和氣道重塑，其可能機(jī)制為通過調(diào)節(jié)HMGB1和MMP-9的表達(dá)。