孟 婕，任一帆，張 貝，耿立英，張傳生，李祥龍

(河北科技師范學(xué)院 河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066600)

疾病是制約我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要因素，從遺傳角度出發(fā)，鑒定免疫相關(guān)的抗病基因，利用其培育抗病新品種，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)疾病的徹底根治具有較好的理論和實(shí)踐意義[1，2]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAFs)，是機(jī)體抗病毒信號(hào)通路中重要的接頭分子。它主要通過(guò)參與腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)、Toll樣受體/白細(xì)胞介素-1受體家族(TIR)和維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體家族(RLRs)轉(zhuǎn)導(dǎo)上游信號(hào)[3～5]，激活NF-κB(nuclear factor κB)，MAPK(mitogen-activated protein kinase)和IRF(Interferon regulatory factors)下游通路[5，6]。目前已發(fā)現(xiàn)TRAFs家族有7個(gè)成員，分別命名為T(mén)RAF1，TRAF2，TRAF3，TRAF4，TRAF5，TRAF6和TRAF7。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在物種進(jìn)化上較為保守，TRAFs的C端(TRAF7除外)有一個(gè)具有共同特征的TRAF結(jié)構(gòu)域；除TRAF1的N端只有一個(gè)簡(jiǎn)單的鋅指結(jié)構(gòu)外，其他TRAFs分子都含有若干個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和一個(gè)RING指基序[7～10]。

隨著雞基因組測(cè)序的完成，使得在基因組水平上研究雞TRAFs家族的信息成為可能。本次研究擬對(duì)雞TRAFs家族成員進(jìn)行鑒定，通過(guò)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、直系和旁系同源基因的研究，為進(jìn)一步研究TRAFs家族的功能、揭示雞TRAFs家族抗病分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雞TRAFs家族成員的鑒定與序列特征分析

從Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)(https://asia.ensembl.org/index.html)下載雞基因組序列信息和基因組基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件。以Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載TRAF(PF00917，PF02176)的隱馬可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)作為查詢(xún)搜索獲得雞可能TRAFs的蛋白序列，并利用Batch CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)及 SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)進(jìn)行驗(yàn)證分析，刪除缺失結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得雞TRAFs家族候選基因。利用在線工具ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)雞TRAFs家族成員的等電點(diǎn)和蛋白分子量等屬性。

1.2 雞TRAFs家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載鼠和人的TRAFs蛋白序列，將其與雞TRAF蛋白序列整合。利用MEGA X的clustal W將鼠、人和雞TRAF蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析[11]。并通過(guò)鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)在MEGA X中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展值(Bootstrap)設(shè)定為1 000。

1.3 雞TRAFs家族成員結(jié)構(gòu)和保守域分析

TRAF的外顯子和內(nèi)含子位置信息參考雞基因組注釋信息GFF3文件，之后利用TBtools工具繪制雞TRAF基因在染色體上的位置及CDS(外顯子)-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)[12]。利用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測(cè)分析TRAF蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，搜索motif值設(shè)定為10。通過(guò)TBtools工具繪制MEME結(jié)構(gòu)并繪制TRAF的結(jié)構(gòu)域[13]。

1.4 雞TRAFs家族染色體定位和基因復(fù)制類(lèi)型分析

利用下載的雞基因組序列信息和基因組基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件通過(guò)TBtools工具提取位置信息并構(gòu)建雞染色體定位圖。TRAF在雞基因組中的復(fù)制類(lèi)型由TBtools及其他輔助工具獲得，并標(biāo)注在染色體上。

1.5 TRAFs家族共線性分析

通過(guò)TBtools工具的Graphics板塊結(jié)合基因組序列信息和基因組基因結(jié)構(gòu)注釋信息GFF3文件對(duì)雞、鴨、鵝等3個(gè)物種進(jìn)行分析。用Multipe synteny plot對(duì)物種間的共線性進(jìn)行可視化[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞TRAFs家族的鑒定及理化性質(zhì)

用生物信息學(xué)方法并經(jīng)過(guò)后續(xù)的篩選驗(yàn)證，去掉重復(fù)項(xiàng)后從雞全基因組中得到7條基因序列。將7條雞TRAFs家族基因序列按照基因ID從ChTRAF1～ChTRAF7命名。最后對(duì)雞TRAFs家族進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。雞TRAFs家族的氨基酸序列長(zhǎng)度最長(zhǎng)的為670 aa，最短的為195 aa。家族成員蛋白分子量最大的是74 943.36 ku，最小的為22 329.87 ku。從理論等電點(diǎn)來(lái)看，ChTRAF1，ChTRAF6和ChTRAF7的等電點(diǎn)小于7，為酸性蛋白。其中，ChTRAF6的等電點(diǎn)最小，為6.01。ChTRAF家族不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，鑒定為不穩(wěn)定蛋白。所有成員的疏水性都小于零，均為親水蛋白。

2.2 雞TRAFs家族與外群TRAFs家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了進(jìn)一步了解雞TRAFs家族和鼠、人之間的同源關(guān)系，用雞、鼠和人的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，雞的7個(gè)TRAF基因可分為7組(圖1)。7個(gè)成員與鼠和人的TRAF家族成員分別聚集，說(shuō)明其進(jìn)化關(guān)系較近。雞多個(gè)亞家族的成員與鼠和人對(duì)應(yīng)亞家族的相似性達(dá)100%。

表1 雞TRAFs家族理化性質(zhì)分析

注：ChTRAF表示雞，h表示人，m表示鼠。羅馬數(shù)字表示亞家族分類(lèi)。遺傳距離標(biāo)尺顯示在左下角。節(jié)點(diǎn)上的值為通過(guò)Bootstrap檢驗(yàn)次數(shù)的百分?jǐn)?shù)。圖1 雞、老鼠、人TRAFs家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 雞TRAFs家族結(jié)構(gòu)特征分析

利用TBtools工具繪制了雞TRAFs家族成員的結(jié)構(gòu)特征圖。對(duì)雞TRAFs家族的7個(gè)成員進(jìn)行了蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，共獲取了10個(gè)保守motif元件(圖2)。不同TRAF保守基元數(shù)量從4～10不等且分布不同，整體來(lái)說(shuō)，亞家族Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ保守基元分布相似。亞家族Ⅳ的編碼序列較其他亞家族結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。TRAF的保守結(jié)構(gòu)域多位于N端。Ⅳ亞家族的內(nèi)含子數(shù)量最少，而且從基因全長(zhǎng)來(lái)看，有著相似CDS長(zhǎng)度的基因全長(zhǎng)不一樣，說(shuō)明內(nèi)含子長(zhǎng)度具有較大差異性。

圖2 雞TRAFs家族成員的保守基序與基因結(jié)構(gòu)

雞TRAFs家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)域特征見(jiàn)圖3。N端都有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，ChTRAF7的C末端為7個(gè)重復(fù)的WD40。TBtools作圖顯示，TRAF1結(jié)構(gòu)域與前人研究結(jié)果不符，N端存在RING結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖3 雞TRAFs家族成員特征結(jié)構(gòu)域

圖4 TRAF1成員特征結(jié)構(gòu)域

2.4 雞TRAFs家族的染色體定位分析

雞TRAF染色體位置信息顯示，7條基因不均勻的分布在3號(hào)、5號(hào)、14號(hào)、17號(hào)和19號(hào)等5條染色體上(圖5)，其中ChTRAF5基因定位在3號(hào)染色體上，ChTRAF3和ChTRAF6基因定位在5號(hào)染色體上，ChTRAF7基因定位在14號(hào)染色體上，ChTRAF1和ChTRAF2基因定位在17號(hào)染色體上，ChTRAF4基因定位在19號(hào)染色體上。同一條染色體上的基因分布不相連，不存在重復(fù)區(qū)域。

圖5 TRAF在雞染色體上的位置

2.5 TRAFs家族共線性分析及可視化

雞、鴨和鵝之間的共線性關(guān)系見(jiàn)圖6。除了ChTRAF4之外，其余6個(gè)雞TRAF基因可以在鴨和鵝染色體上找到對(duì)應(yīng)的旁系同源基因。

圖6 雞、鴨和鵝TRAFs家族共線性分析結(jié)果

3 討 論

TRAF家族成員屬于一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)家族，存在于各種動(dòng)物中。TRAFs家族的全基因組鑒定僅在極少數(shù)物種中被分析報(bào)道[15～17]。TRAF1和TRAF2主要參與介導(dǎo)抗凋亡信號(hào)、受體信號(hào)的反饋調(diào)節(jié)及JNK的活化；TRAF3參與介導(dǎo)T細(xì)胞依賴(lài)的抗病毒機(jī)制；TRAF4與氣管的形成有關(guān)；TRAF5介導(dǎo)CD40與CD27信號(hào)；TRAF6可直接與白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶、NF-κB受體激活因子及CD40結(jié)合來(lái)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；TRAF7主要介導(dǎo)caspase依賴(lài)的凋亡信號(hào)[18～20]。雖然雞TRAFs家族成員在先天免疫系統(tǒng)中的作用已有報(bào)道[21，22]，然而雞TRAFs家族的系統(tǒng)鑒定鮮有報(bào)道。

本次研究通過(guò)隱馬可夫模型對(duì)雞基因組中TRAFs家族的搜索分析，鑒定其有7個(gè)成員。ChTRAF基因家族可分為7個(gè)亞家族，Ⅴ亞家族定位在3號(hào)染色體上，Ⅲ和Ⅵ亞家族定位在5號(hào)染色體上，Ⅶ亞家族定位在14號(hào)染色體上，Ⅰ和Ⅱ亞家族定位在17號(hào)染色體上，Ⅳ亞家族定位在19號(hào)染色體上。對(duì)雞中TRAFs家族進(jìn)行多方面的分析鑒定，發(fā)現(xiàn)ChTRAF1，ChTRAF6和ChTRAF7的等電點(diǎn)小于7，為酸性蛋白。ChTRAF家族不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，鑒定為不穩(wěn)定蛋白。所有成員的疏水性都小于零，均為親水蛋白。對(duì)染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，雞TRAFs家族成員不存在串聯(lián)重復(fù)關(guān)系，說(shuō)明基因間差異較大。通過(guò)共線性分析發(fā)現(xiàn)，只有6個(gè)基因在不同物種之間找到了旁系同源基因，說(shuō)明TRAFs家族成員在不同物種的進(jìn)化過(guò)程中，承受不同的選擇壓力但也存在一定保守性。

基因結(jié)構(gòu)是研究基因功能和基因進(jìn)化的重要依據(jù)。本次研究詳細(xì)分析了雞TRAFs家族的結(jié)構(gòu)特征和保守結(jié)構(gòu)域?；蚨己型怙@子內(nèi)含子，從基因全長(zhǎng)來(lái)看，有著相似CDS長(zhǎng)度的基因全長(zhǎng)不一樣，說(shuō)明內(nèi)含子長(zhǎng)度具有較大差異性。功能域分析發(fā)現(xiàn)，每條基因所翻譯的蛋白結(jié)構(gòu)中都含有該亞家族的特征結(jié)構(gòu)域。ChTRAF家族成員含有典型的TRAF分子的功能結(jié)構(gòu)域，包括MATH結(jié)構(gòu)域、指環(huán)結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域[23]。Bradley等[7]研究顯示，TRAF1在N端沒(méi)有RING結(jié)構(gòu)域，但本次研究鑒定表明ChTRAF1的N端含有RING結(jié)構(gòu)域。在NCBI搜索人、鼠、日本鵪鶉等物種的TRAF1蛋白序列進(jìn)行特征結(jié)構(gòu)域分析顯示，某些物種TRAF1的N端含有RING結(jié)構(gòu)域(圖4)。這一現(xiàn)象表明，TRAFs家族在物種間進(jìn)化保守的同時(shí)有物種差異性。