徐 燕，垢志霞，韓金玲，俎天嬌，王艷敏，喬亞科，李桂蘭*

(1 河北科技師范學(xué)院，農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 河北省(秦皇島)甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]為雙子葉植物綱，旋花科甘薯屬一年或多年生草本植物[1]。甘薯既可以作為糧食作物，又可以作為飼料作物和輕工業(yè)原料[2]，具有廣泛的應(yīng)用。我國(guó)甘薯種植面積約660萬(wàn)hm2，占我國(guó)耕地總面積約4.2%，而甘薯產(chǎn)量占世界甘薯總產(chǎn)量85%左右；我國(guó)甘薯種植面積和甘薯總產(chǎn)量均居世界首位[3～6]。

近年來(lái)，冀東地區(qū)推廣種植的甘薯品種病毒病發(fā)生嚴(yán)重，特別是主要種植的淀粉型品種盧選1號(hào)受病毒病危害嚴(yán)重，減產(chǎn)30%以上，使當(dāng)?shù)馗适砩a(chǎn)受到極大影響。為此，筆者參考前人的方法，試驗(yàn)開展甘薯品種脫病毒技術(shù)研究，以期為冀東地區(qū)生產(chǎn)脫病毒甘薯種苗提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本次試驗(yàn)選用3個(gè)甘薯品種，其中煙薯25和北京553屬于鮮食型甘薯品種，而盧選1號(hào)為冀東地區(qū)主推淀粉型品種。試驗(yàn)于2019年6月～11月在河北科技師范學(xué)院植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 外植體消毒處理

選取生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲害的甘薯苗，先剪取莖尖1～2 cm，用洗潔精浸泡2 min再用清水沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上，用提前滅菌的無(wú)菌水沖洗3次，再用體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇浸泡30 s，不斷地用玻璃棒攪勻，然后用ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒5 ～15 min，最后用無(wú)菌水沖洗5～6次。在無(wú)菌環(huán)境下，使用解剖鏡觀察，用注射器與解剖刀切取0.2～0.4 mm，放在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。設(shè)6個(gè)消毒處理(表1)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4瓶，每瓶接5個(gè)莖尖。在培養(yǎng)過(guò)程中不斷檢查污染和死亡的莖尖，并記錄，40 d后統(tǒng)計(jì)污染率和死亡率，3個(gè)月后調(diào)查成苗率，篩選出最佳消毒方法。

1.3 培養(yǎng)基的激素配比

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度激素6-BA和IBA，在無(wú)菌條件下分別剝離煙薯25，北京553，盧選1號(hào)的莖尖，接種在各處理組合的培養(yǎng)基上(表2)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4瓶，每瓶接5個(gè)莖尖。培養(yǎng)50 d觀察莖尖萌發(fā)數(shù)、出芽數(shù)、成苗率等。

表1 甘薯種苗莖尖脫毒的表面消毒處理方法

表2 甘薯種苗莖尖脫毒培養(yǎng)基6-BA與IBA的配比

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件初步統(tǒng)計(jì)分析，DPS7.05進(jìn)行Duncan新復(fù)極差法顯著性檢驗(yàn)。

外植體接種培養(yǎng)后，在固定時(shí)間內(nèi)調(diào)查污染率、死亡率、成苗率等指標(biāo)，篩選出最佳培養(yǎng)方案。

污染率=(污染莖尖數(shù)/接種的總莖尖數(shù))×100%

死亡率=(未污染死亡莖尖數(shù)/接種的總莖尖數(shù))×100%

成苗率=(成苗的莖尖數(shù)/接種的總莖尖數(shù))×100%

莖尖成活率=(成活的莖尖數(shù)/接種的總莖尖數(shù))×100%

莖尖分化率=(誘導(dǎo)出芽的莖尖數(shù)/接種的總莖尖數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)甘薯莖尖消毒效果的影響

2.1.1對(duì)煙薯25莖尖培養(yǎng)的影響ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒處理9 min煙薯25莖尖成苗率最高，達(dá)到41.67%。在ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒處理時(shí)，隨著NaClO消毒處理時(shí)間的增加，接種外植體成苗率先升后降(表3)。

表3 不同消毒處理對(duì)煙薯25莖尖培養(yǎng)的影響

2.1.2對(duì)盧選1號(hào)莖尖培養(yǎng)的影響ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒處理9 min盧選1號(hào)莖尖培養(yǎng)污染率最低，但13 min消毒效果最好，莖尖成苗率為36.67%(表4)。

表4 不同消毒處理對(duì)盧選1號(hào)甘薯莖尖培養(yǎng)的影響

2.1.3對(duì)北京553莖尖培養(yǎng)的影響 外植體經(jīng)過(guò)ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒處理后11 min及13 min北京553莖尖培養(yǎng)污染率最低，均為3.33%，而處理11 min莖尖成苗率最高(表5)。

表5 不同消毒處理對(duì)北京553甘薯莖尖培養(yǎng)的影響

總之，由于甘薯品種的不同，外植體的消毒時(shí)間也不一致。ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒時(shí)，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率和成苗率逐漸降低。

2.2 6-BA與IBA不同濃度組合對(duì)甘薯莖尖組織培養(yǎng)的影響

將不同品種甘薯的莖尖在6-BA與IBA不同濃度組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右，莖尖有明顯的變化：膨大和轉(zhuǎn)綠。15 d后不同培養(yǎng)基上的莖尖出現(xiàn)愈傷組織，25 d后有的莖尖分化成芽。

2.2.1對(duì)煙薯25莖尖組織培養(yǎng)的影響 在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基上，煙薯25莖尖分化率最高，分化率為93.33%。在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA與MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基上的煙薯25成苗率最高，均達(dá)到91.67%。在相同的6-BA濃度下，隨著IBA濃度的增加，莖尖分化率先升高后降低，隨著6-BA的濃度增加，愈傷組織逐漸變大，芽的分化比較慢(表6)。

表6 6-BA與IBA不同濃度的組合對(duì)煙薯25甘薯莖尖組織培養(yǎng)的影響

2.2.2對(duì)盧選1號(hào)莖尖組織培養(yǎng)的影響 盧選1號(hào)在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基上莖尖分化效果最佳，分化率為75.00%，成苗率也最高，達(dá)到75.00%(表7)。

表7 6-BA與IBA不同濃度的組合對(duì)盧選1號(hào)甘薯莖尖組織培養(yǎng)的影響

2.2.3對(duì)北京553莖尖組織培養(yǎng)的影響 北京553在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好，莖尖分化率達(dá)到85.00%，成苗率為73.33%(表8)。

表8 6-BA與IBA不同濃度的組合對(duì)北京553甘薯莖尖組織培養(yǎng)的影響

2.2.4不同甘薯品種莖尖成活率及成苗率的比較 通過(guò)對(duì)品種間的莖尖成活率差異顯著性測(cè)驗(yàn)，煙薯25的莖尖成活率最高，達(dá)到92.89%；北京553次之，為84.56%；盧選1號(hào)最低，是為75.45%，3個(gè)品種之間莖尖成活率差異均達(dá)到顯著性水平(表9)。而莖尖成苗率上，煙薯25的莖尖成苗率最高，達(dá)到62.44%，顯著高于北京553和盧選1號(hào)，而北京553與盧選1號(hào)的莖尖成苗率差異不顯著(表9)。

表9 不同品種間莖尖成活率及成苗率差異比較

由此可知，不同品種的莖尖成活率與成苗率各不相同，本次試驗(yàn)結(jié)果得出的莖尖成活率及成苗率由高到低的順序是：煙薯25，北京553，盧選1號(hào)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

近年來(lái)，甘薯因病毒病越來(lái)越嚴(yán)重導(dǎo)致種薯退化而失去其優(yōu)良性狀[14]。但由于病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，病毒在植物體內(nèi)形成2種傳播方式，一種是由于莖尖分生組織尚未形成維管束，病毒顆粒不易通過(guò)，只能通過(guò)胞間連絲進(jìn)行傳播[15]；另一種是隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)維管束進(jìn)行傳播，速度較快。因此我們通常利用莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，獲得帶有極少病毒或無(wú)毒的苗[16]。進(jìn)而培育脫毒種薯，是解決甘薯種薯退化最有效方法之一。

在甘薯莖尖脫毒的整個(gè)過(guò)程中控制污染率與死亡率是最關(guān)鍵的，如何在整個(gè)過(guò)程中降低污染率和死亡率，提高成活率，消毒在整個(gè)過(guò)程中起著重要作用。消毒時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)莖尖成活率影響很大，如果消毒時(shí)間短，莖尖易污染，導(dǎo)致消毒不徹底，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，莖尖失去活性，成活率會(huì)降低[17]。因此消毒時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)莖尖組織的培養(yǎng)有至關(guān)重要的作用。

不同激素配比對(duì)甘薯莖尖組織培養(yǎng)有重要影響[18]，激素濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于莖尖生長(zhǎng)，濃度過(guò)高抑制莖尖生長(zhǎng)甚至?xí)劳?，濃度過(guò)低不利于誘導(dǎo)莖尖生長(zhǎng)的啟動(dòng)。

3.2 結(jié)論

(1)煙薯25，盧選1號(hào)與北京553分別用ρ(NaClO)=20.0 g·L-1消毒處理9 min，13 min，11 min污染率最低，成苗率最高。

(2)煙薯25 在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基培養(yǎng)，莖尖分化率最高，莖尖分化率為93.33%；盧選1號(hào)在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)分化效果最佳，莖尖分化率為75.00%；北京553 在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好，莖尖分化率達(dá)到85.00%。

(3)在芽誘導(dǎo)分化的MS培養(yǎng)基中加入適量的6-BA和IBA有利于莖尖的分化，過(guò)多會(huì)抑制莖尖的生長(zhǎng)。在不同甘薯品種的莖尖培養(yǎng)過(guò)程中的成活率與成苗率存在顯著性差異，本次試驗(yàn)結(jié)果得出煙薯25的莖尖成活率及成苗率均最高，北京553次之，盧選1號(hào)最低。