曹 歡，池偉偉，桑呂萍，趙 雷，于苗苗，王寶山

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050011 2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050031 3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 保 定 071000)

喉鱗癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是耳鼻喉-頭頸外科及腫瘤外科常見的一種惡性實(shí)體腫瘤。隨著相關(guān)研究的逐步開展，有關(guān)LSCC的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)作用機(jī)制研究有了一定的認(rèn)識，但鑒于復(fù)雜多樣的lncRNA調(diào)控機(jī)制來說，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制尤為必要[1]。既往研究報(bào)道，長鏈非編碼RNA LINC01133在胰腺腫瘤、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2,3]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其在LSCC中的相關(guān)研究。本研究對LINC01133在LSCC中的表達(dá)臨床意義及功能進(jìn)行了深入探討。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞系來源:由河北醫(yī)科大學(xué)耳鼻咽喉頭頸外科生物樣本庫留存并傳代培養(yǎng)的4株LSCC細(xì)胞系(TU212、TU686、TU177、AMC-HN-8)。

1.2組織樣本來源:LSCC癌與癌旁組織樣本均取自于2016年10月至2019年4月接受手術(shù)的LSCC患者，由河北醫(yī)科大學(xué)耳鼻咽喉頭頸外科生物樣本庫負(fù)責(zé)收集并儲存，所有患者均已簽署書面同意。本實(shí)驗(yàn)獲得河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)及河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3臨床資料:該研究納入48例LSCC患者組織樣本，其中男性47例，女性1例，年齡44～77歲，中位年齡59歲，見表1。其中59歲(中位年齡)作為年齡的分組標(biāo)準(zhǔn)，TNM分期參照LSCC國際抗癌協(xié)會(huì)(UICC 2012)分期標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 LSCC患者臨床參數(shù)

1.4總RNA提取及cDNA合成：實(shí)驗(yàn)中所涉及細(xì)胞系、組織樣本總RNA提取及cDNA合成，均參照課題組前期研究[1]。

1.5LINC01133相對表達(dá)水平檢測：LINC01133相對表達(dá)水平檢測及計(jì)算方法均參照課題組前期研究[1]。相關(guān)引物如下，LINC01133上游5’-GTACCAAGGTGTGCTGAAG-3’，下游5’- GCATAGACTTGAGGTTCCATT-3’，產(chǎn)物125bp，GAPDH引物參照前期研究[1]。

1.6特異性shRNA載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：針對LINC01133的特異性shRNA載體設(shè)計(jì)及合成，由上海吉瑪公司完成。序列如下，sh1-LINC01133-GTGCCTCTGAGTTTGTTTACT；sh2-LINC01133-CCTTATTCTTTATGAGGCACT；sh3-LINC01133-CGGGAAGATTTCCTAATCTCA；sh4-LINC01133-CTTGAAGTTACCTGAGAATGG；shGAPDH-GTATGAACAACAGCCTCAAG；shNC-GTTCTCCGAACGTGTCACGT。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine?2000(Invitrogen，USA)說明書操作步驟完成。轉(zhuǎn)染后常規(guī)培養(yǎng)24h，通過倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，Japan)觀察轉(zhuǎn)染效率，并提取各組細(xì)胞系總RNA，檢測各shRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中LINC01133表達(dá)改變情況，評估各shRNA干擾效率，并選擇干擾效率明顯的shRNA-LINC01133用于后續(xù)功能試驗(yàn)。

1.7過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：LINC01133過表達(dá)質(zhì)粒(LINC01133-pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-))由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)并制備。通過Lipofectamine?2000(Invitrogen，USA)轉(zhuǎn)染試劑，按相關(guān)說明書操作步驟完成各組質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24h，分別提取各組細(xì)胞系總RNA，并通過qRT-PCR的方法，檢測表達(dá)載體轉(zhuǎn)染前后，細(xì)胞中LINC01133相對表達(dá)水平的改變趨勢，評估表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率，并選擇過表達(dá)效果明顯的載體用于后續(xù)功能試驗(yàn)。

1.8CCK-8實(shí)驗(yàn)：各組生長狀態(tài)良好的細(xì)胞系，分別制備呈單個(gè)細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，按每孔100ul(2000個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔4個(gè)重復(fù)，接種后常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后開始檢測，分別于0、24、48、72、96h每孔加入10ul CCK-8試劑(MCE，China)，孵育3h后通過Spark?多功能酶標(biāo)儀(TECAN，Switzerland)檢測450nm吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9克隆形成實(shí)驗(yàn)：各組生長狀態(tài)良好的細(xì)胞系，分別制備呈單個(gè)細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，按每孔2ml(含2000個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔設(shè)置3個(gè)重復(fù)，常規(guī)培養(yǎng)10d，PBS溶液清洗3遍、多聚甲醛(4%)固定并晾干、結(jié)晶紫溶液(0.5%)染色，鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)(含有50個(gè)細(xì)胞以上的集落計(jì)數(shù)為一個(gè)克隆)，計(jì)算克隆形成率。

1.10Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：各組生長狀態(tài)良好的細(xì)胞系，分別制備呈單個(gè)細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，按每孔200ul(含1×105個(gè)細(xì)胞)(無胎牛血清)，接種于24孔板Transwell小室(Corning Costar，USA)上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基650ml，按常規(guī)方法培養(yǎng)24h，PBS溶液清洗3遍、多聚甲醛(4%)固定并晾干、結(jié)晶紫溶液(0.5%)染色，計(jì)數(shù)穿透上室并貼附于基底的細(xì)胞數(shù)(5個(gè)視野)。

1.11Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測：Matrigel基質(zhì)膠(Corning，USA)包被Transwell小室上室基底膜，待基質(zhì)膠固化后接種細(xì)胞，其余步驟參照Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)。

1.12qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測：通過干擾載體影響各細(xì)胞系中LINC01133的相對表達(dá)后，提取總RNA，采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞系中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)mRNA表達(dá)水平的變化，進(jìn)而分析LINC01133對細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。相關(guān)引物如下，E-cadherin上游5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3，下游5’-GGCCTTTTGACTGTAATCACACC-3'，產(chǎn)物162bp；N-cadherin上游5’-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3’，下游5’-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3'，產(chǎn)物205bp；Vimentin上游5’-CGCCTGCAGGATGAGATTCAG-3’，下游5’-TCAGGGAGGAAAAGTTTGGAAGA-3’，產(chǎn)物175bp。

2 結(jié) 果

2.1與對照組(10例LSCC癌旁正常組織中LINC01133相對表達(dá)水平平均值，定義為對照組Pool[1])相比，LINC01133相對表達(dá)水平在LSCC細(xì)胞系中明顯增高(見圖1)。圖1中Pool代表10例LSCC癌旁正常組織中LINC01133相對表達(dá)水平的平均值，與Pool相比，LSCC各細(xì)胞系中LINC01133相對表達(dá)水平明顯增高(TU177，P=0.003；TU686，P=0.009；AMC-HN-8，P=0.002；TU212，P=0.160)。

圖1 LINC01133在LSCC細(xì)胞系中的表達(dá)差異與Pool比較，1)P<0.05

2.2與配對癌旁正常組織相比，在48例LSCC組織樣本中，28例癌組織中LINC01133表達(dá)增高(圖2a，2b)，且從整體水平比較，LINC01133在癌組織中相對表達(dá)水平(3.71±2.47)明顯高于其在配對癌旁正常組織中相對表達(dá)水平(3.04±2.05)，(P=0.012)(圖2c)。

圖2 LINC01133在LSCC組織樣本中的表達(dá)趨勢

2.3臨床相關(guān)性分析提示，LINC01133相對表達(dá)水平與患者某些臨床參數(shù)相關(guān)。低分化LSCC患者組織樣本LINC01133相對表達(dá)水平(4.86±2.20)高于中-高分化組織樣本(3.24±2.45)，(P=0.037)。晚期(Ⅲ～Ⅳ)組織樣本LINC01133相對表達(dá)水平(4.29±2.71)明顯高于早期(Ⅰ～Ⅱ)LSCC患者組織樣本(2.65±1.52)，(P=0.026)。伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織樣本LINC01133相對表達(dá)水平(4.38±2.65)高于不伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC患者組織樣本(2.93±2.02)，(P=0.041)。而LINC01133相對表達(dá)水平與患者年齡、吸煙、飲酒無明顯相關(guān)(P>0.05)。由于LSCC好發(fā)于男性，本研究48例樣本，1例女性，故未進(jìn)行相關(guān)分析。此外，LSCC亞解剖分型中，聲門型居多，聲門上型次之，而聲門下型LSCC較為少見，本研究所采集樣本中，僅有1例聲門下型LSCC組織樣本，故僅針對聲門型、聲門上型與LINC01133的相對表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，且未發(fā)現(xiàn)二者有明顯相關(guān)性(P>0.05),見表2。

表2 LINC01133相對表達(dá)水平與臨床病理特征相關(guān)性

2.4考慮LINC01133在LSCC各細(xì)胞系中的表達(dá)水平及載體轉(zhuǎn)染效率，選擇TU177細(xì)胞系用于shRNA載體功能實(shí)驗(yàn)，同時(shí)選擇LINC01133相對表達(dá)水平較低的TU686細(xì)胞系進(jìn)行pcDNA3.1(-)過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染。靶向LINC01133的特異性shRNA載體，能夠使得細(xì)胞系TU177中LINC01133的相對表達(dá)水平明顯受到抑制，而4個(gè)shRNA均能不同程度的敲低LINC01133的表達(dá)，其中sh1-LINC01133效果最明顯，故用于后續(xù)研究(圖3a)。LINC01133過表達(dá)載體(pcDNA3.1(-)-LINC01133)能夠明顯增加細(xì)胞系TU686中LINC01133的表達(dá)(圖3b)。

2.5體外功能實(shí)驗(yàn)提示，與對照組相比，敲低LINC01133的表達(dá)，能夠抑制TU177細(xì)胞的增殖能力(圖4a)，而過表達(dá)LINC01133，能夠促進(jìn)TU686細(xì)胞的增殖能力(圖4b)。此外，與對照組相比，敲低LINC01133的表達(dá)，能夠明顯抑制TU177細(xì)胞的遷移(圖4c)及侵襲能力(圖4d)，而過表達(dá)LINC01133能夠明顯促進(jìn)TU686細(xì)胞的遷移(圖4e)及侵襲能力(圖4f)。

圖4 LINC01133表達(dá)改變對LSCC細(xì)胞惡性表型的作用

2.6通過載體降低LSCC細(xì)胞系TU177中LINC01133的表達(dá)，能夠阻滯細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的進(jìn)展，而過表達(dá)細(xì)胞系TU686中LINC01133的表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程(圖5a，5b)。與對照組中E-cadherin(1.01±0.18)、N-cadherin(1.01±0.12)、Vementin(1.00±0.07)表達(dá)水平相比，敲低細(xì)胞系TU177中LINC01133的表達(dá)后，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)(1.73±0.28)，P<0.05，而N-cadherin(0.47±0.12)、Vementin(0.54±0.06)的表達(dá)下調(diào)，P<0.01；與對照組中E-cadherin(0.91±0.10)、N-cadherin(1.00±0.08)、Vementin(1.00±0.10)表達(dá)水平相比，過表達(dá)細(xì)胞系TU686中LINC01133的表達(dá)后，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)(0.63±0.06)，P<0.05，而N-cadherin(1.81±0.10)、Vementin(2.83±0.42)的表達(dá)上調(diào)，P<0.01。

圖5 LINC01133對LSCC細(xì)胞系上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的影響

3 討 論

根據(jù)lncRNA與蛋白質(zhì)編碼基因在DNA的相互位置關(guān)系，可分為正義、反義、基因內(nèi)、基因間和雙向lncRNA等五種類型，而LINC01133屬于基因間長鏈非編碼RNA，能夠促進(jìn)多種腫瘤的惡性進(jìn)展[4]。LINC01133可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外增殖、遷移及侵襲能力，并能調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展和抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生[5]。胰腺癌中LINC01133表達(dá)水平明顯增高，可能通過Wnt信號通路，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長、增殖、遷移及侵襲能力[2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，LINC01133可能通過激活PI3K/Akt途徑促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[3]。然而，目前LINC01133在LSCC中的表達(dá)及其功能尚不明確，既往研究發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA如反義lncRNA ZNF667-AS1在LSCC中低表達(dá)，能夠影響細(xì)胞惡性表型的進(jìn)展[6]。

本研究證實(shí)LINC01133在LSCC組織及細(xì)胞系中的高表達(dá)，并與患者的臨床分期、組織分化程度、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)，提示LINC01133的表達(dá)水平與LSCC的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)。進(jìn)一步研究證實(shí)，LINC01133能夠促進(jìn)LSCC細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲能力。有研究表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在LSCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而某些lncRNA能夠通過不同途徑參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的調(diào)控。如MIR155HG通過miR-155-5p/XOS10信號通路促進(jìn)LSCC的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程及惡性表型的進(jìn)展[7]。MEG3可以通過上調(diào)Twist1和Vimentin的表達(dá)并抑制E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)LSCC細(xì)胞系Hep-2細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[8]。另有研究表明，sirt1 AS通過直接靶向結(jié)合sirt1并增加其mRNA穩(wěn)定性，從而能夠抑制TGF-β1介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[9]。而本研究提示LINC01133可能通過抑制E-cadherin表達(dá)的同時(shí)，促進(jìn)N-cadherin和Vementin的表達(dá)，從而對上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化具有一定的調(diào)控作用。但LINC01133對E-cadherin，N-cadherin和Vementin的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究證實(shí)了LINC01133在LSCC組織中的高表達(dá)與患者的臨床分期、組織分化程度及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性相關(guān)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)LINC01133能夠誘導(dǎo)LSCC細(xì)胞系惡性進(jìn)展及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)展，提示LINC01133可能通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑參與了LSCC的發(fā)生發(fā)展。本研究為后續(xù)LSCC相關(guān)標(biāo)志物的篩選及靶向治療中靶標(biāo)的篩選具有一定的參考意義。