張成偉，唱 寬，毛志剛，舒 建

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院心胸外科，遼寧 沈陽 110042)

由于環(huán)境污染、飲食習慣改變等多種因素，食管癌患病率攀升到惡性腫瘤第8位，不同的人種、地區(qū)食管癌類型有一定差別，在我國絕大部分患者為食管鱗癌(Esophageal squamous carcinoma，ESCC)[1,2]。與大多數惡性腫瘤相同，早期ESCC無明顯臨床癥狀，晚期患者5年生存率僅10%，臨床治療以手術為主，因此需要可預防ESCC轉移和復發(fā)的治療策略，進一步提高患者預后生存情況[3,4]。隨著人們對免疫系統的深入研究，發(fā)現了程序性死亡分子配體1(Programmed death ligand 1，PD-L1)與其受體(PD-1)組成的信號通路對免疫細胞有調控作用[5]。本研究檢測了免疫細胞CD8+/FOXP3+比值和PD-L1在ESCC組織中的表達情況，結合患者預后情況進行分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料：將2014年1月至2019年1月我院行ESCC根治術患者的存檔蠟塊和癌旁正常組織(距病變部位>5cm處，且證實為無癌浸潤)石蠟標本各110例作為研究對象。癌與癌旁組織取樣于男性92例，女性18例；年齡43～86歲，平均(73.64±6.09)歲。

1.2納入及排除標準：納入標準：①均行ESCC根治術；②無放化療治療史；③經術后細胞學及組織學病理確診為ESCC，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度。排除標準：①經CT、MRI等影像學診斷無法確定TNM分期；②合并其他惡性腫瘤；③已診斷為遠處轉移；④伴隨肺間質疾病或嚴重肝腎功能障礙；⑤患有血液系統疾病或傳染病等。

1.3免疫組化：切取4μm厚石蠟組織切片，行常規(guī)HE復染確認。經烤片、脫蠟、水化后，進行抗原熱修復、阻斷內源性過氧化物酶、封閉非特異性結合后，滴加一抗室溫下孵育。TBST沖洗后滴加新鮮配制的DAB顯色，2～3min后用自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，封固后于顯微鏡下觀察。已知的PD-L1、CD8+、FOXP3+陽性標本為陽性對照。觀察高倍(×400)視野下陽性細胞百分數及染色強度(見圖1)，陽性細胞占比≤5%為0分、占比為6%～25%計1分、占比26%～50%計2分、占比51%～75%計3分、占比≥76%計4分；細胞未染色計0分、淡黃色為1分、棕黃為2分、棕褐為3分，總分=細胞染色評分×細胞占比評分，總分≥3分即為陽性表達。結果評判由2人進行雙盲讀片確定。

圖1 ①ESCC組織中PD-L1陽性表達；②ESCC組織中FOXP3+陽性表達，細胞核染色；③ESCC組織中CD8+陽性表達，細胞膜染色

1.4觀察指標：①比較CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的陽性表達；②收集110例ESCC患者臨床資料，分析年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、浸潤、分化程度與CD8+/FOXP3+、PD-L1陽性表達的關系；③對110例ESCC根治術患者通過電話或門診的形式隨訪，末次隨訪時間為2020年1月，統計患者生存情況，分析CD8+/FOXP3+、PD-L1表達與1年生存率的關系，無失訪患者。

2 結 果

2.1CD8+/FOXP3+比值、PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的表達：CD8+/FOXP3+在ESCC組織中的陽性表達率低于癌旁組織，PD-L1在ESCC組織中的陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 ECD8+/FOXP3+ PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的表達

2.2CD8+/FOXP3+比值、PD-L1與ESCC臨床病理參數間的關系：不同TNM分期、淋巴結轉移情況、浸潤程度、腫瘤直徑和分化程度的ESCC組織中CD8+/FOXP3+、PD-L1的陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；但不同年齡、性別的ESCC組織中CD8+/FOXP3+比值、PD-L1 CD8+/FOXP3+表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 CD8+/FOXP3+比值 PD-L1與ESCC臨床病理參數間的關系

2.3影響ESCC患者預后生存的單因素分析：110例行ESCC根治術患者1年總生存率為86.36%(95/110)，單因素分析顯示，TNM分期T1～2期的患者1年生存率為高于T3期患者；合并淋巴結轉移患者1年生存率低于未合并淋巴結轉移患者；PD-L1陽性表達組患者1年生存率低于陰性表達組患者；CD8+/FOXP3+陽性表達組患者1年生存率高于陰性表達組患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，不同年齡、性別、浸潤程度、腫瘤直徑的ESCC根治術患者生存率比較無差異(P>0.05)，見表3。

表3 影響ESCC患者預后生存的單因素分析

2.4影響ESCC患者預后生存的多因素分析：以ESCC患者術后1年生存情況為因變量，以上述有統計學意義項(TNM分期、淋巴結轉移、PD-L1、CD8+/FOXP3+)作為自變量，對上述因素進行賦值，(TNM分期：T1～2期=1、T3期=0；淋巴結轉移：無=1、有=0；PD-L1：陰性=1、陽性=0；CD8+/FOXP3+：陽性=1、陰性=0)，并將其納入Logisitic回歸模型中，發(fā)現TNM T3期分期、合并淋巴結轉移、PD-L1陽性表達、CD8+/FOXP3+陰性表達是ESCC患者預后的獨立影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響ESCC患者預后生存的多因素分析

3 討 論

近年來環(huán)境污染加劇，人們飲食習慣改變，食管癌患病率逐年攀升，在我國絕大部分患者表現為ESCC，早期ESCC無明顯臨床癥狀，晚期患者5年生存率僅10%。ESCC的發(fā)病率逐年升高，根治性手術和術后輔助化療是目前的主要治療手段，ESCC因部位特殊性、腫瘤大小、分化程度等指標會影響根治性手術切除的效果和預后情況[6]。目前對行ESCC根治術患者預后的預測主要通過檢測血清腫瘤標志物水平和明確TNM分期，但二者對ESCC患者預后的判斷準確度較低[7]。因此，繼續(xù)尋找新的生物學標志物對提高患者的術后治療效果顯得尤為必要。

PD-1/PD-L1通路在惡性腫瘤的發(fā)展中有負向調節(jié)作用，PD-L1作為一種跨膜蛋白，對免疫細胞有一定活化作用，可以幫助腫瘤細胞逃避免疫系統淋巴細胞的進攻，關嵩[8]等研究指出經免疫組化檢測發(fā)現PD-L1在ESCC患者組織中的陽性表達率與性別、腫瘤分期、分化程度相關。又有研究指出PD-L1在ESCC組織中的陽性表達率遠高于正常組織[9]。CD8+對腫瘤細胞的殺傷力在多項研究中被證實，通過分泌穿孔素和淋巴毒素等多種方式殺死腫瘤細胞；而FOXP3+基因突變會引發(fā)自身免疫缺陷疾病，阻礙淋巴細胞的調節(jié)功能；所以CD8+/FOXP3+比值的表達情況與自身免疫系統的功能相關，CD8+/FOXP3+表達越高，免疫系統在抗腫瘤過程中發(fā)揮的效用越高[10]。高翔[11]等的研究提示術前血清中性粒淋巴細胞比值與患者預后密切相關。本研究中，ESCC的TNM分期、淋巴結轉移情況和浸潤程度影響CD8+/FOXP3+和PD-L1的表達情況，腫瘤的直徑、分化程度影響PD-L1表達，說明PD-L1和CD8+/FOXP3+的表達與多項臨床病理參數都有關系，可能對患者的預后有影響。

本研究對比了患者預后生存情況，110例行ESCC根治術患者1年總生存率為86.36%(95/110)，單因素分析顯示PD-L1陽性表達患者1年生存率低于陰性表達患者；CD8+/FOXP3+陽性表達患者1年生存率高于陰性表達患者，提示PD-L1陰性表達與CD8+/FOXP3+陽性表達對患者預后有正向影響，這與PD-L1激活后幫助腫瘤細胞進一步發(fā)展、FOXP3+陰性表達影響免疫系統的正常運作、CD8+陽性表達利于溶解腫瘤細胞的功能相關。多因素分析結果顯示，TNM T3期分期、合并淋巴結轉移、PD-L1陽性表達、CD8+/FOXP3+陰性表達是影響ESCC患者預后的獨立危險因素，提示CD8+/FOXP3+陽性表達、PD-L1陰性表達、TNM分期為T3期、有淋巴結轉移的行ESCC根治術的患者可能出現不良預后，應在臨床治療中重點觀察。本研究亦存在不足之處，回顧性研究選例存在偏倚，有待日后擴大樣本進行前瞻性研究，驗證CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC患者體內的表達與其預后生存的關系。

綜上所述，CD8+/FOXP3+陽性表達、PD-L1陰性表達、TNM分期為T3期、有淋巴結轉移是影響ESCC根治術后患者預后的獨立危險因素，可以為今后免疫治療藥物、患者術后治療提供一定參考。