李俊平，張愛(ài)武，張芳

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010059

氟尿嘧啶(5-FU)作為臨床常用抗癌藥，對(duì)胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等有很好的療效。但5-FU會(huì)引起較強(qiáng)的不良反應(yīng)，其中免疫損傷以及骨髓造血功能抑制最為常見(jiàn)，主要表現(xiàn)為免疫功能降低、外周血細(xì)胞數(shù)量減少。因此，盡可能減少5-FU帶來(lái)的不良反應(yīng)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1]。蛹蟲(chóng)草又名北冬蟲(chóng)夏草，屬蟲(chóng)草菌屬，與名貴藥材冬蟲(chóng)夏草是同屬異種。蛹蟲(chóng)草含有多種生物活性成分，包括蟲(chóng)草多糖、多肽、蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素等，其藥用和保健價(jià)值廣泛，可發(fā)揮降糖、調(diào)脂、保肝、護(hù)腎、抗腫瘤等功效[2～4]。蟲(chóng)草多糖作為蛹蟲(chóng)草的活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的作用[5]。然而蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)5-FU引起的骨髓損傷的影響還不明確。因此，本研究使用5-FU處理大鼠，使用蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)其進(jìn)行保護(hù)性干預(yù)，評(píng)估該藥對(duì)5-FU處理大鼠骨髓功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 蛹蟲(chóng)草菌種由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室提供。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切成1 cm3小塊，加水沸煮30 min，8層紗布過(guò)濾，加入20 g葡萄糖，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。Wistar大鼠40只，雄性，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。5-FU注射液(規(guī)格：0.25 g×10 mL)購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；人IFN-γ ELISA試劑盒、人IL-4 ELISA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo；7020全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本HITACHI。

1.2 蛹蟲(chóng)草多糖的制備

1.2.1 菌種培養(yǎng) 采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法。取蛹蟲(chóng)草斜面1支，將菌絲體刮入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d得到種子培養(yǎng)液，以10%的接種量接種至500 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d得到發(fā)酵液，鏡檢觀察菌體。

1.2.2 蛹蟲(chóng)草多糖的提取 發(fā)酵液過(guò)濾得到菌絲體，凍干機(jī)凍干，微粉粉碎機(jī)粉碎破壁。蛹蟲(chóng)草多糖的提取采用水溶醇沉法。取蛹蟲(chóng)草細(xì)粉100 g，加入1 L純水混勻，40 kHz超聲提取30 min。80 ℃加熱回流1 h，趁熱過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL。攪拌下加入2 L乙醇沉淀多糖，靜置30 min，過(guò)濾，乙醇洗滌沉淀。加適量水全溶沉淀，加4倍量乙醇再沉淀，過(guò)濾，乙醇洗滌沉淀。60 ℃烘干，得到蛹蟲(chóng)草多糖粗品5.62 g，得率為5.62%。

1.2.3 蛹蟲(chóng)草多糖的精制 ①蛋白質(zhì)的去除。使用Sevag法去除蛋白質(zhì)。氯仿和正丁醇按5∶1的比例混勻配制Sevag液，粗多糖濃縮液與Sevag液按4∶1的體積混合，劇烈震蕩30 s后離心，取上清液，反復(fù)用Sevag液處理5次，收集上清液。②DEAE-52分離。使用DEAE-52裝柱，多糖上樣，依次用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脫，各洗脫150 mL，流速0.5 mL/min。收集洗脫液，每管5 mL，苯酚—硫酸法490 nm下檢測(cè)洗脫液OD值。只有水洗脫出峰，其余NaCl溶液均未洗脫出峰。水洗脫得到一個(gè)主峰，合并主峰洗脫液，旋蒸濃縮。另有少量雜峰，由于含量較低，不做收集。③Sephadex G-100分離。使用Sephadex G-100裝柱，將DEAE-52分離出的多糖上樣，水洗脫，流速0.5 mL/min，收集洗脫液，每管5 mL，苯酚—硫酸法檢測(cè)洗脫液OD值，得到一個(gè)主峰，合并主峰洗脫液，旋蒸濃縮，得到多糖純品，其余雜峰不做處理。④HPLC法檢測(cè)。使用HPLC法檢測(cè)Sephadex G-100分離得到的多糖純品。流動(dòng)相為5%的甲醇水溶液，流速1 mL/min，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，得到一個(gè)對(duì)稱單一峰，保留時(shí)間10.03 min。

1.3 動(dòng)物分組與給藥 將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、蛹蟲(chóng)草多糖低劑量組、蛹蟲(chóng)草多糖高劑量組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組腹腔注射15 mg/(kg·d)的5-FU溶液，對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥6 d。造模結(jié)束后，蛹蟲(chóng)草多糖低、高劑量組分別給予20、60 mg/kg的蛹蟲(chóng)草多糖粗品灌胃，3次/d，連續(xù)給藥3周，其余組給予同等體積的生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般情況觀察 在給藥的第0、3、6、9、12、15、18、21天測(cè)定并觀察大鼠體質(zhì)量、毛發(fā)、腹瀉的發(fā)生等情況。

1.4.2 外周血細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 給藥完成后，取血，處死大鼠。將大鼠血液保存于含有抗凝劑的采血管內(nèi)，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)。

1.4.3 外周血IFN-γ、IL-4水平測(cè)定 取大鼠全血，10 000 r/min離心20 min，取上層血清，ELISA法測(cè)定血清IFN-γ和IL-4。以IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2。

1.4.4 骨髓DNA含量測(cè)定 取大鼠股骨，用0.005 mol/L CaCl2沖洗骨髓至離心管中，4 ℃放置30 min，1 000 r/min離心15 min，棄上清。用0.2 mol/L HClO4懸浮沉淀，震蕩混勻，90 ℃水浴15 min，冷卻。2 000 r/min離心10 min，保留上清，以0.2 mol/L HClO4為空白。酶標(biāo)儀于268 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，DNA含量=OD值×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況觀察結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組大鼠毛發(fā)有脫落現(xiàn)象，出現(xiàn)集體腹瀉，且體質(zhì)量下降。與模型組相比，蛹蟲(chóng)草多糖低劑量組和高劑量組大鼠體質(zhì)量有所改善，但由于大鼠間個(gè)體差異較大，組間比較并未表現(xiàn)出差異，毛發(fā)脫落現(xiàn)象也無(wú)明顯改善。各組體質(zhì)量比較見(jiàn)表1。

表1 各組體質(zhì)量比較

2.2 各組外周血細(xì)胞含量比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較 結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各組外周血細(xì)胞含量比較

表3 各組血清IFN-γ、IL-4水平比較

2.4 各組骨髓DNA含量比較 對(duì)照組、模型組、蛹蟲(chóng)草多糖低劑量組、蛹蟲(chóng)草多糖高劑量組骨髓DNA含量分別為7.08±0.86、2.58±0.47、4.65±0.97、5.84±0.73，模型組較對(duì)照組低(P<0.01)，蛹蟲(chóng)草多糖低劑量組、蛹蟲(chóng)草多糖高劑量組較模型組高(P<0.05或<0.01)。

3 討論

由放化療所導(dǎo)致的免疫抑制以及骨髓損傷是腫瘤治療過(guò)程中難以避免的嚴(yán)重副作用。骨髓是人體重要的免疫和造血器官，由骨髓產(chǎn)生的造血干細(xì)胞可分化成紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞等發(fā)揮生物學(xué)功能，使用化療藥物后，骨髓受損，造成血細(xì)胞數(shù)量和免疫功能的降低。Th1/Th2是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。Th1和Th2細(xì)胞由輔助T細(xì)胞產(chǎn)生，正常情況下Th1和Th2細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡中，且兩種細(xì)胞相互抑制。當(dāng)機(jī)體免疫功能受到抑制時(shí)，Th2占據(jù)優(yōu)勢(shì)，Th1/Th2比值降低，相反，其比值越高，免疫應(yīng)答水平越顯著[6,7]。Th1表達(dá)IFN-γ，IFN-γ能刺激B細(xì)胞，介導(dǎo)體液免疫，產(chǎn)生抗體；Th2表達(dá)IL-4，IL-4屬于抑炎因子，能夠抑制炎癥的發(fā)生。Th1/Th2的平衡是機(jī)體免疫平衡的重要標(biāo)志[8,9]。骨髓DNA含量是造血干細(xì)胞數(shù)量的體現(xiàn)。DNA是遺傳信息的載體，細(xì)胞中的DNA會(huì)在損傷因素的作用下斷裂，斷裂的DNA則會(huì)進(jìn)一步降解，細(xì)胞中DNA含量的減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖減緩[10]。因此，骨髓DNA含量的降低會(huì)造成骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量的減少。本研究檢測(cè)大鼠外周血細(xì)胞含量、Th1/Th2、骨髓DNA含量，觀察了蛹蟲(chóng)草多糖灌胃對(duì)5-FU處理大鼠骨髓功能的影響。

基于中醫(yī)的辨證施治理論，對(duì)于免疫損傷的治療采取補(bǔ)氣、補(bǔ)血、健脾、補(bǔ)腎類藥物[11～14]。蟲(chóng)草屬包括冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草、秦山蛹蟲(chóng)草、香棒蟲(chóng)草、蒙山蟲(chóng)草等在內(nèi)的多種真菌，具有相似的化學(xué)成分[15,16]。其中以傳統(tǒng)中藥冬蟲(chóng)夏草研究最多，大量的研究表明，冬蟲(chóng)夏草的多糖組分具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等功效，然而價(jià)格昂貴，限制其廣泛應(yīng)用[17,18]。蛹蟲(chóng)草價(jià)格低廉、易培養(yǎng)，已被認(rèn)為是冬蟲(chóng)夏草的替代品[4]。研究表明，蛹蟲(chóng)草多糖可提高小鼠的免疫力和抗氧化能力[19]，并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW246.7的吞噬功能[20,21]。本研究前期通過(guò)水溶醇沉法獲得蛹蟲(chóng)草多糖粗品，得率為5.62%，使用DEAE-52和Sephadex G-100進(jìn)一步對(duì)粗品進(jìn)行提純，獲得蛹蟲(chóng)草多糖純品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究大鼠腹腔注射5-FU建立模型，給予蛹蟲(chóng)草多糖灌胃干預(yù)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠外周血RBC、WBC、PLT、Hb減少，骨髓DNA含量減少，Th1/Th2明顯降低；與模型組相比，蛹蟲(chóng)草多糖高劑量組大鼠外周血RBC、WBC、PLT、Hb增加，骨髓DNA含量增加，Th1/Th2升高。表明蛹蟲(chóng)草多糖能夠有效緩解由5-FU所致的大鼠骨髓功能損傷。

綜上可見(jiàn)，蛹蟲(chóng)草多糖灌胃可改善5-FU處理大鼠骨髓功能，但該藥能否用于減輕臨床化療藥物帶來(lái)的毒性反應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。