王雪平， 耿 悅， 朱惠斌*

(1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南開(kāi)封 475004；2.開(kāi)封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開(kāi)封 475004)

二氯吡啶酸(Clopyralid)，又名3,6-二氯吡啶-2-羧酸、3,6-二氯吡啶羧酸，商品名畢克草Ⅱ號(hào)(CAS號(hào)1702-17-6)，是一種人工合成的擬植物激素型除草劑，屬內(nèi)吸性農(nóng)藥，施藥后會(huì)很快被雜草葉片、根部吸收，并傳遞到全株各部位。其除草作用機(jī)理為促進(jìn)雜草DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，致使根部生長(zhǎng)過(guò)量、莖及葉生長(zhǎng)畸形、養(yǎng)分消耗，維管束輸導(dǎo)功能受阻，導(dǎo)致雜草死亡，可徹底殺死敏感深根雜草[1 - 3]。二氯吡啶酸已成為農(nóng)業(yè)廢水中新型污染物，若過(guò)量濫用，二氯吡啶酸可通過(guò)多種途徑污染土壤、水體，從而引發(fā)對(duì)非靶標(biāo)植物、動(dòng)物繁殖、植物群落等一系列問(wèn)題[4 - 7]。歐盟規(guī)定飲用水中單個(gè)農(nóng)藥的殘留量≤0.1 mg/kg；我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2016)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定，小麥、玉米、油菜籽中二氯吡啶酸最大殘留量分別為2、1、2 mg/kg，但尚未制訂水中二氯吡啶酸殘留限量和分析方法。因此，建立高效、準(zhǔn)確的水中二氯吡啶酸殘留量檢測(cè)方法具有重要意義。

目前關(guān)于二氯吡啶酸測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[8 - 10]、氣相色譜法[11,12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13]，分析對(duì)象大多為二氯吡啶酸原藥及其水溶性粒劑、油菜、土壤、植物源性食品等，而關(guān)于農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸殘留量檢測(cè)報(bào)道較少。攪拌棒吸附萃取(Stir Bar Sorptive Extraction,SBSE)是一種新型固相微萃取樣品前處理技術(shù)[14,15]，該技術(shù)具有萃取容量高、無(wú)需外加攪拌子、可避免競(jìng)爭(zhēng)性吸附、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在痕量物質(zhì)分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文在優(yōu)化攪拌棒吸附萃取條件和液相色譜-質(zhì)譜法參數(shù)的基礎(chǔ)上，建立了SBSE-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸殘留量，以期為農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸殘留監(jiān)控提供檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY型超高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司)；Xevo TQ MS型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，Waters公司)；Milli-Q超純水器(美國(guó)，Millipore公司)；ME204E電子分析天平(瑞士，Mettler公司)；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器(美國(guó)，Scientific Industries公司)；AVANTI J-15型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)，Beckman Coulter公司)；SKY-211D型恒溫培養(yǎng)振蕩器(江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司)；TTL-DC氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；攪拌棒(德國(guó)，Gerstel公司)，棒長(zhǎng)10 mm，聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜厚0.5 mm，萃取相涂層25 μL。

二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，美國(guó)A Chemtek Inc.公司)。二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量的二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用時(shí)用初始流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。甲醇、乙腈為色譜純；NaCl、HCl均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜條件：UPLC BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～2.0 min,90%～30%A;2.0～4.0 min,30%～10%A;4.0～4.1 min,10%～90%A;4.1～10.0 min,90%A。流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源(EI)；負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；干燥氣溫度450 ℃；干燥氣流速600 L/h；碰撞氣氬氣，流速0.15 mL/min。二氯吡啶酸多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式條件：定性離子對(duì)m/z189.9/35.1；定量離子對(duì)m/z189.9/146.1；錐孔電壓18 V；碰撞能量10 eV。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確移取10 mL樣品，置于50 mL離心管中，加入PDMS攪拌棒，控制NaCl質(zhì)量濃度為100 g/L；在溫度20 ℃下，以100 r/min攪拌萃取30 min；加入甲醇10 mL，以100 r/min振蕩解吸30 min，解吸液在45 ℃ 氮吹濃縮近干，加入初始流動(dòng)相溶解并定容至1 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 二氯吡啶酸二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectrum of clopyralid

圖2 二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of clopyralid standard solution

以蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣，將1.0 μg/mL二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)注入電子轟擊電離源中，分別采用正離子模式或負(fù)離子模式對(duì)二氯吡啶酸進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果表明：采用負(fù)離子模式時(shí)，可獲得質(zhì)荷比(m/z)為189.9的高豐度[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，這可能與二氯吡啶酸分子結(jié)構(gòu)中羧基易失去H有關(guān)；以準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行子離子掃描，并在MRM模式下優(yōu)化碰撞能量和錐孔電壓，獲得的二級(jí)碎片離子主要為m/z35.1、74.1、92.0、146.1(圖1)，其中m/z35.1信號(hào)最穩(wěn)定，m/z146.1信號(hào)最強(qiáng)，因此選擇m/z35.1為定性離子，選擇m/z146.1為定量離子。

2.2 色譜條件的選擇

分別考察色譜柱的類型(Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Waters BEH C18、Shim-pack VP-ODS C18)，流動(dòng)相的組成(甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇/乙腈-5 mmol/L NH4Ac溶液)對(duì)二氯吡啶酸的色譜分離效果和離子化效率的影響。結(jié)果表明：采用Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Shim-pack VP-ODS C18色譜柱時(shí)，二氯吡啶酸色譜峰較寬，出峰時(shí)間較長(zhǎng)(6.82～8.74 min)，而Waters BEH C18色譜柱對(duì)二氯吡啶酸的出峰時(shí)間適中(5.32 min)、分離度好、靈敏度高、峰形對(duì)稱且尖銳。采用Waters BEH C18作為分析柱，以甲醇/乙腈-水或甲醇/乙腈-5 mmol/L NH4Ac溶液為流動(dòng)相時(shí)，二氯吡啶酸峰形較差，出現(xiàn)基線漂移；以甲醇/乙腈和0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖響應(yīng)值較高，尤其有機(jī)相選擇乙腈時(shí)，色譜峰峰形更窄，且峰形尖銳對(duì)稱、分離效果最好，色譜分離情況見(jiàn)圖2。

2.3 攪拌棒萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 攪拌棒萃取影響因素分析以PDMS攪拌棒對(duì)農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸萃取率為考察指標(biāo)，采用單一變量法分別研究萃取時(shí)間、萃取溫度、攪拌速率、pH值、離子強(qiáng)度對(duì)二氯吡啶酸的萃取效率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)萃取時(shí)間在10～30 min時(shí)，二氯吡啶酸萃取效率隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增高；當(dāng)萃取溫度在30～50 ℃時(shí)，二氯吡啶酸萃取效率隨著萃取溫度的升高而降低；當(dāng)攪拌速率在50～150 r/min時(shí)，二氯吡啶酸萃取效率隨著攪拌速率的增大而增高；離子強(qiáng)度可影響二氯吡啶酸在農(nóng)業(yè)廢水和PDMS攪拌棒涂層中的分配系數(shù)，加入質(zhì)量濃度為50～100 g/L NaCl，二氯吡啶酸萃取效率隨著攪拌速率的增大而增高；當(dāng)農(nóng)業(yè)廢水中pH值在5～8時(shí)，二氯吡啶酸萃取效率受pH值的影響較少。因此，影響PDMS攪拌棒對(duì)農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸萃取效率的因素主要為：萃取時(shí)間、萃取溫度、攪拌速率、離子強(qiáng)度。

2.3.2 正交試驗(yàn)分析選取萃取時(shí)間(A)、萃取溫度(B)、攪拌速率(C)、離子強(qiáng)度(D)四個(gè)因素，選用3個(gè)水平，設(shè)計(jì)因素水平表(表1)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)和方差分析(表3)進(jìn)行PDMS攪拌棒萃取條件優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

從表3中可知，影響PDMS攪拌棒萃取條件的因素為；B>A>D>C；PDMS攪拌棒萃取最優(yōu)條件為：A2B1C2D3，即PDMS攪拌棒萃取時(shí)間30 min，萃取溫度20 ℃，攪拌速率100 r/min，離子強(qiáng)度100 g/L。從表4中可知，萃取時(shí)間、萃取溫度、攪拌速率、離子強(qiáng)度對(duì)正交試驗(yàn)無(wú)顯著性影響。

2.4 攪拌棒解吸條件的優(yōu)化

分別考察了解吸液、解吸時(shí)間、解吸模式對(duì)PDMS攪拌棒對(duì)農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸解吸效率的影響。結(jié)果表明：甲醇對(duì)攪拌棒PDMS涂層吸附的二氯吡啶酸具有良好的解吸效果，解吸率可達(dá)98.6%；解吸時(shí)間在5～15 min范圍內(nèi)，二氯吡啶酸的解吸率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)解吸時(shí)間增加到30 min時(shí)，二氯吡啶酸的解吸率不再發(fā)生變化，趨于平衡；與靜態(tài)解吸模式相比，動(dòng)態(tài)解吸模式經(jīng)攪拌或振蕩能顯著提高甲醇溶劑傳遞，從而加速被攪拌棒吸附的二氯吡啶酸解吸。因此本實(shí)驗(yàn)解吸條件選擇：采用動(dòng)態(tài)解吸模式，以甲醇作為解析液，解吸時(shí)間30 min。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的影響

為避免農(nóng)業(yè)廢水中非目標(biāo)物對(duì)攪拌棒萃取二氯吡啶酸時(shí)產(chǎn)生干擾，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法分析二氯吡啶酸在純乙腈和不含目標(biāo)物的農(nóng)業(yè)廢水中的基質(zhì)效應(yīng)(ME=B/A×100%，B為農(nóng)業(yè)廢水基質(zhì)中目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)值，A為純乙腈基質(zhì)中目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)值)[16]。結(jié)果表明：在純乙腈和不含目標(biāo)物的農(nóng)業(yè)廢水兩種基質(zhì)中分別加入終濃度為1.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L三種水平濃度的二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文所建方法SBSE-液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定二氯吡啶酸質(zhì)譜響應(yīng)值，經(jīng)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)在92.1%～97.3%之間。這表明采用SBSE-液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸時(shí)，不存在基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

依次配制質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按本文所建立的方法進(jìn)行測(cè)定，以二氯吡啶酸的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，二氯吡啶酸的質(zhì)譜響應(yīng)值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)20份不含目標(biāo)物的空白農(nóng)業(yè)廢水樣品進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限，以S/N=10為定量限。結(jié)果表明：二氯吡啶酸質(zhì)量濃度在1.0 ng/mL～50.0 ng/mL范圍內(nèi)與其質(zhì)譜響應(yīng)值呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=8127.3x+654.2，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9998；檢出限為0.3 μg/L，定量限為1.0 μg/L。

2.7 加標(biāo)回收率和精密度

隨機(jī)選取具有代表性的3種農(nóng)業(yè)廢水，依次添加終濃度為1.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL二氯吡啶酸標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定6次，按本文所建立的方法測(cè)定加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可知：在1.0～50.0 ng/mL加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，二氯吡啶酸平均加標(biāo)回收率在87.8%～97.8%范圍，RSD在0.9%～4.7%之間。該方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

表4 回收率和精密度(n=6)

(續(xù)表4)

圖3 農(nóng)業(yè)廢水樣品中二氯吡啶酸總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram ofclopyralid in agricultural wastewater

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文所建立的SBSE-LC-MS/MS法，對(duì)30份實(shí)際農(nóng)業(yè)廢水樣品進(jìn)行二氯吡啶酸殘留量測(cè)定。結(jié)果表明：30份所檢測(cè)的農(nóng)業(yè)廢水中，4份農(nóng)業(yè)廢水檢出二氯吡啶酸，見(jiàn)圖3。陽(yáng)性檢出率為13.3%，殘留量在8.3～257.2 μg/L之間；4份陽(yáng)性農(nóng)業(yè)廢水采集地附近為油菜、小麥種植區(qū)，二氯吡啶酸殘留可能是由于防除闊葉雜草而噴施含有二氯吡啶酸的除草劑引起的。

3 結(jié)論

本研究在優(yōu)化攪拌棒吸附萃取條件和液相色譜-質(zhì)譜法參數(shù)的基礎(chǔ)上，建立了SBSE-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸含量的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有操作簡(jiǎn)便、試劑消耗少、準(zhǔn)確度高、檢出限低等特點(diǎn)，可為農(nóng)業(yè)廢水中二氯吡啶酸含量監(jiān)測(cè)提供檢測(cè)方法。