趙超群， 劉 柱， 袁 堃， 羅金文

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052)

磺胺類藥物是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)一類藥物的總稱，該類藥物用于預(yù)防和治療細菌感染性疾病，具有抗菌譜廣、抗菌效果明顯、性質(zhì)穩(wěn)定、價格便宜等優(yōu)點[1]，目前大量用于防治畜禽細菌性感染疾病。我國天然地表水中藥物殘留含量最高、分布最廣的即為磺胺類藥物?；前奉愃幬锟赏ㄟ^多種途徑進入水環(huán)境，如醫(yī)療排廢、畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖等。但該類藥物在環(huán)境中不易降解，并且通過食物鏈的富集，導(dǎo)致越來越多的耐藥菌產(chǎn)生，最終可能會危害人體健康[2，3]。水環(huán)境中磺胺類藥物的殘留問題已越來越引起人們的重視，國內(nèi)外已有大量的研究報道了其在各種水環(huán)境中的殘留狀況[4 - 6]。

磺胺類藥物目前常用的檢測方法主要有免疫分析法[7]、毛細管帶電泳法[8]、氣相色譜法[9]、液相色譜法[10，11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12 - 14]。液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法是測定磺胺類藥物最常用的檢測手段。四極桿-線性離子阱(QTRP)既保留了串聯(lián)四極桿較好的選擇性和靈敏度，也可作為線性離子阱增強二級碎片離子定性功能，采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息依賴型采集-增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式檢測，一次進樣即可得到用于定量的MRM圖譜和用于定性的二級圖譜，更有利于微量目標化合物的定性[15]。本研究采用固相萃取技術(shù)對目標化合物進行凈化和富集，應(yīng)用同位素內(nèi)標法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的MRM-IDA-EPI分析模式，并建立多能級檢索譜庫，為飲用水中磺胺類化合物的檢測提供新途徑。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

AB5500-QTRAP質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；LC-30AD超高效液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)；全自動氮氣吹干儀(美國，Biotage公司)；Milli-Q型超純水器(美國，Millipore公司)；全自動固相萃取儀(中國?？乒?；XPE-205電子天平(瑞士，Mettler toledo公司)；QT-1渦旋混合器(上海琪特公司)。Waters Oasis HLB固相萃取柱(6 cc，500 mg，美國，Waters公司)。

磺胺乙酰(SAA)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲惡唑(SMO)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺二甲異惡唑(SFZ)、磺胺苯甲酰(SBA)、磺胺苯吡唑(SPA)、磺胺喹惡啉(SQX)標準物質(zhì)，均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度均大于98.0%；磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)標準物質(zhì)購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于97.5%；磺胺索嘧啶(SIM)標準物質(zhì)購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，純度為99.1%。同位素內(nèi)標磺胺喹惡啉-13C6(SQX-13C6)、磺胺甲基嘧啶-13C6(SMR-13C6)購自WiTEGA，磺胺地索辛-D6(Sulfadimethoxine -D6)購自ANPEL，磺胺甲惡唑-D4(Sulfamethoxazole -D4)購自CDN Isotopes INC。甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；Na2EDTA、HCl(分析純，國藥集團)；甲酸(質(zhì)譜純，美國Roe Scientificing公司)。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 對照品儲備液分別精密稱取17種磺胺類藥物10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的標準儲備液，于-18 ℃下保存。分別精密移取STZ、SPD、SMR、SDM、SMT、SMM、SMZ、SFZ、SPA標準儲備液100 μL，SAA標準儲備液500 μL，SDZ、SMO、SMP、SBA、SIM標準儲備液200 μL，SCP標準儲備液50 μL，SQX標準儲備液400 μL，用甲醇定容，即得混合對照品中間液，于-18 ℃下保存。

1.2.2 同位素內(nèi)標儲備液分別精密稱取SQX-13C6、MSDS -D6、SMR-13C6、磺胺甲惡唑-D4各1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成100 μg/mL的內(nèi)標儲備液，于-18 ℃下保存。精密移取100 μL各同位素內(nèi)標儲備液，用甲醇定容至100 mL，即得100 ng/mL的同位素內(nèi)標中間液，于-18 ℃下保存。

1.3 樣品處理

采集自來水水樣于1 L棕色玻璃瓶中，在4 ℃保存，采集后盡快進行前處理，保存時間不超過3 d。10批礦泉水購于浙江市場。取500 mL待測水樣，精密加入100 μL混合同位素內(nèi)標中間液，經(jīng)0.7 μm孔徑玻璃纖維濾膜過濾，加入0.2 g Na2EDTA混合溶解后，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH至3.0，上樣至預(yù)先活化的HLB固相萃取小柱(4 mL甲醇、4 mL水活化，5 mL pH為3.0的稀HCl平衡)，控制流速為3～5 mL/min，用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，抽干后用10 mL甲醇洗脫，于40 ℃氮吹至近干，用50%甲醇水溶液定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，待上機分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters CORTECS T3柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0.01～2.0 min，10%B；2.0～6.0 min，10%～60%B；6.0～8.0 min，60%B；8.0～8.1 min，60%～10%B；8.1～10.0 min，10%B。流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子(ESI+)掃描；噴霧電壓5.5 kV；霧化氣壓力(GS1)50 psi，輔助器壓力(GS2)50 psi，氣簾氣壓力(CUR)40 psi；優(yōu)化后的母離子、子離子和錐孔電壓、聚焦電壓、碰撞能量等MRM參數(shù)見表1。

采用MRM-IDA-EPI模式檢測，建立在線EPI譜庫檢索輔助定性分析，同位素內(nèi)標法定量分析，IDA參數(shù)：啟動EPI閾值為5 000 cps，采用動態(tài)背景扣除模式；EPI參數(shù)：掃描速度10 000 Da/s，掃描范圍為m/z50～320 Da，采用動態(tài)填充肼集時間，不大于1 ms，EPI碰撞能量(CE)：35±15 eV。

表1 MRM模式檢測下17種磺胺類藥物及內(nèi)標物的質(zhì)譜條件

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了四種不同類型的色譜柱，基于Water CORTECS T3柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)在反相液相色譜條件下對極性化合物有較好保留，且對堿性化合物有良好的選擇性，實驗發(fā)現(xiàn)其對磺胺類化合物的保留分離效果最好，因此，選擇其作為色譜柱進行分離。比較了乙腈-水和甲醇-水兩種流動相，結(jié)果表明，使用甲醇-水作為流動相時，分離度良好，但出現(xiàn)了拖尾、峰寬較寬的問題，使用乙腈-水作為流動相，分離度和峰形明顯優(yōu)于甲醇-水。為了進一步提高待測化合物的離子化效率，增強靈敏度，結(jié)合目前LC-MS/MS法的相關(guān)報道[16]，磺胺只有在酸性溶液中才能以分子狀態(tài)存在，很好地與固定相作用而被保留和分離，且電離時能較好地生成[M+H]+而被檢測。因此，最終確定流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液，再優(yōu)化流動相比例，選擇梯度洗脫，目標物分離度好，保留時間適中。優(yōu)化后的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品的提取離子色譜(EIC)圖Fig.1 EIC chromatograms of mixed reference standards

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

歐盟規(guī)定LC-MS/MS檢測中，物質(zhì)定性時相對離子強度誤差的最大允許范圍不大于20%，且必須要有4個鑒別點數(shù)，即一個母離子加兩個子離子才能實現(xiàn)定性。但是在目標化合物的濃度很低時，絕對響應(yīng)也很低，極有可能會影響目標分析物的離子相對豐度比，結(jié)果的確證帶來困難。本研究采用MRM-IDA-EPI掃描模式，優(yōu)化MRM條件后，在掃描過程中，使MRM通道采集的信號超過5 000 cps后，觸發(fā)EPI增強離子掃描，CE為20、35、50 eV時，獲得對應(yīng)MRM通道的母離子的增強二級離子全掃描質(zhì)譜，獲得足夠的碎片離子信息，包含特征離子峰，實現(xiàn)一次進樣定性定量。根據(jù)17種化合物的響應(yīng)程度，優(yōu)化MRM-IDA-EPI的各參數(shù)，獲得增強二級離子全掃描質(zhì)譜圖(圖2)，建立17種磺胺類藥物的EPI譜庫。

圖2 17種磺胺類藥物在線增強離子掃描(EPI)譜圖Fig.2 Enhanced product ion(EPI) spectra of 17 sulfonamides

2.3 MRM-IDA-EPI譜圖結(jié)果評價

以加標樣品為例，濃度為25倍定量限，在具體分析過程中采用MRM-IDA-EPI模式進行檢測，在各化合物對應(yīng)保留時間均能獲得3個不同碰撞能量的EPI譜圖，在新建的磺胺類藥物標準譜庫中進行檢索，根據(jù)低中高3個不同碰撞能量所得的EPI碎片離子混合圖，每個化合物均能得到相應(yīng)的EPI譜圖匹配結(jié)果。以匹配值(Fit值)、反向匹配值(Revfit值)、純度值(Purity值)作為定性結(jié)果的依據(jù)，其中Fit值代表標準物質(zhì)譜圖與樣品譜圖進行對比后獲得的相似度值(滿分為100)，Revfit值代表反向匹配后獲得的相似度值，Purity值是綜合前兩種結(jié)果得出的數(shù)值[15]。加標結(jié)果顯示，17種磺胺類藥物的Fit值、Revfit值、Purity值均能獲得滿意結(jié)果，建立的EPI譜庫可實現(xiàn)在無需對照品的情況下即能完成簡單的定性，具體分析結(jié)果見表2。

表2 加標樣品EPI譜庫檢索結(jié)果

2.4 固相萃取柱的選擇

基于磺胺類化合物中含有-NH2基團，因此本實驗考察了MCX、WCX、HLB和MCX與HLB聯(lián)用的凈化富集效果，結(jié)果表明磺胺在MCX柱上難以洗脫，因此MCX柱、MCX與HLB聯(lián)用的回收率均不理想。WCX柱中磺胺二甲惡唑的回收率僅49%，而在HLB上各化合物的回收率均能介于75%～120%間，見圖3。因此最終選擇HLB作為凈化富集柱。

圖3 17種磺胺類藥物在不同固相萃取柱上的回收率Fig.3 Recoveries of 17 sulfonamides on different solid phase extraction columns

2.5 前處理條件的優(yōu)化

實際水樣中存在一定量的重金屬，會與目標化合物產(chǎn)生一定的螯合反應(yīng)，影響最終分析結(jié)果[17]。因此實驗中加入適量Na2EDTA以絡(luò)合部分金屬離子，提高提取效率。分別向500 mL空白自來水樣中加入0、0.5、1.0、2.0 g Na2EDTA，進行加標試驗，加標量為25倍定量限濃度。結(jié)果表明，隨著Na2EDTA加入量增大，除絡(luò)合重金屬離子，同時會影響磺胺類化合物在HLB柱的吸附，在加入0.5 g Na2EDTA時各目標化合物的回收率優(yōu)于其他幾組，所以樣品中Na2EDTA的適宜加入量為0.5 g。實驗還考察了在HLB柱富集和凈化過程中pH值對結(jié)果的影響，分別試驗了pH為3.0和pH為7.0時目標化合物的提取回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH為7.0時磺胺二甲惡唑的回收率在10%以下，pH為3.0時各化合物的提取回收效率均良好(圖3)。因此，待測水樣用0.1 mol/L HCl調(diào)pH至3.0后上樣至固相萃取小柱分析。

2.6 方法學(xué)考察

用甲醇配制定量限至100倍定量限濃度范圍的系列濃度混合標準溶液，磺胺喹惡啉-13C6作為SAA、SDM、SBA、SIM的同位素內(nèi)標，磺胺甲基嘧啶-13C6作為SDZ、STZ、SMP、SMT的同位素內(nèi)標，磺胺地索辛-D6作為SPD、SMR、SMO、SMM、SPA、SQX的同位素內(nèi)標，磺胺甲惡唑-D4作為SMZ、SIM、SFZ的同位素內(nèi)標，以待測物質(zhì)的峰面積和相應(yīng)同位素內(nèi)標物的峰面積的比值為縱坐標(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果表明，17種磺胺類藥物的線性關(guān)系良好，根據(jù)信噪比(S/N)≥3及S/N≥10分別確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見表3。

表3 水中磺胺類藥物的線性關(guān)系、檢出限、定量限和回收率(n=6)

對空白水樣進行加標回收試驗，加標量為5、25、50倍定量限水平，每個濃度設(shè)定6份平行樣，分別考察回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明，各目標化合物的回收率為72.4%～119.9%，RSD為0.4%～8.8%?；旌蠘藴使ぷ饕褐貜?fù)進樣6次，考察儀器精密度，其RSD為2.1%。該方法具有良好的準確性和精密度，可滿足飲用水中磺胺類藥物的檢測。

2.7 實際樣品分析

采用本實驗建立的方法對20份自來水水樣及10份礦泉水水樣進行分析，其中20份自來水采樣自杭州市各個區(qū)，每個區(qū)隨機采樣2份；10份礦泉水購自超市不同品牌。通過比較待測溶液與標準溶液的譜圖定性目標分析物，30份樣品中均未檢出磺胺類化合物，結(jié)果說明在市民平時的飲用水中，磺胺類抗菌藥處于安全水平。

3 總結(jié)

本實驗采用固相萃取技術(shù)富集濃縮，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了飲用水中17種磺胺類藥物殘留的檢測方法。通過方法學(xué)評價，證明在定量限到200倍定量限范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率在72.4%～119.9%，RSD為0.4%～8.8%。本研究為飲用水中磺胺類藥物殘留的檢測提供了新途徑。