張愛梅,郭保民,韓雪英,李曦冉

1 西北師范大學生命科學學院, 蘭州 730070 2 玉門市第一中學, 玉門 735200

植物內生菌是指生活在健康植物的不同器官和組織內,并與宿主植物能夠建立和諧共生關系的一類微生物[1]。植物內生菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實和種子中,具有豐富的多樣性[2]。作為植物的繁殖器官,種子在植物性狀和品質傳承中發(fā)揮著重要作用。種子可作為多種有益細菌和病原菌的載體,已有研究證實植物種子內部攜帶有豐富的微生物種群[3]。在植物種子萌發(fā)和發(fā)育過程中,種子內生菌還能產生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid),直接促進種子的生長,此外,種子內生菌具有溶磷和固氮作用,能促進種子對磷和氮元素的吸收利用,有效提高種子萌發(fā)率、幼苗存活率和生物量積累等[4-5]。

中國沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)是胡頹子科沙棘屬的灌木或小喬木,廣泛分布于干旱、半干旱地區(qū),根系發(fā)達。其根部由于弗蘭克氏菌的侵染,能形成明顯的根瘤[6-7]。現(xiàn)有研究也表明,中國沙棘內生菌有著豐富的組織多樣性,沙棘內生菌不僅存在于其根瘤中[8],還存在于其根、莖和葉等組織中[9],且在這些組織中的內生菌還具有豐富的種類多樣性。但是,關于中國沙棘種子內生菌的研究還鮮有報道,為了深入了解中國沙棘種子內生細菌的多樣性,明確沙棘種子內生細菌的群落結構組成及特點,本研究以分布在甘肅榆中縣和秦安縣的野生中國沙棘為材料,收集其種子,采用純培養(yǎng)技術和高通量測序技術,研究中國沙棘種子內生細菌的多樣性,獲得具有潛在應用價值的種子內生細菌資源。以期探究兩種不同生境的中國沙棘種子內生細菌多樣性差異,為沙棘種子內生細菌多樣性的研究與應用提供參考,并為更進一步開展種子內生細菌相關研究提供有價值的菌株材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1采樣地概況

于2017年9月,在甘肅省榆中縣馬銜山(樣品編號為A)和秦安縣王鋪鄉(xiāng)(樣品編號為B)兩個典型的野生中國沙棘灌叢居群中,以五點取樣法分別選取樹齡基本相同的野生中國沙棘,采集樹上成熟的果實,剝去果肉后,選擇顆粒圓潤、飽滿的種子作為實驗材料,樣地信息詳見表1。

表1 中國沙棘樣地信息

榆中縣馬銜山樣地地處北緯35°46′、東經103°57′,海拔為2791 m,樣地為石質山地林區(qū)；秦安縣王鋪鄉(xiāng)樣地地處北緯35°05′、東經105°23′,海拔為1960 m,樣地為黃土梁地形；兩樣地均為黃土高原高寒陰濕區(qū),采樣地分布有大量的野生中國沙棘。榆中縣馬銜山和秦安縣王鋪鄉(xiāng)兩樣地海拔、年降水量和年均氣溫存在較大差異,土壤類型和pH等環(huán)境因子差異均較小。

1.1.2主要設備與試劑

高壓蒸汽滅菌鍋(DSX-280B),上海博迅實業(yè)有限公司；超凈工作臺(5W-CJ-2FD),蘇州安泰空氣技術有限公司；凝膠成像儀(JS780),Bio-Rad公司；PCR儀(EPC-810),東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀(DYY-12),北京六一生物科技有限公司；恒溫震蕩搖床(H2Q-F160A),上海一恒科學儀器有限公司；高速臺式離心機(TG20-WS),湖南湘立科學儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9080B),上海瑯玕實驗設備有限公司。

PCR擴增引物,北京奧科鼎盛生物科技有限公司；2×ES Taq MasterMix,康為世紀生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂等(北京奧博星生物技術有限責任公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1沙棘種子內生細菌的純培養(yǎng)

(1)沙棘種子可培養(yǎng)內生細菌的分離與純化

稱取1 g沙棘種子樣品于10 mL 離心管中,加5 mL 75%酒精浸泡1 min,再加5 mL 5%次氯酸鈉浸泡5 min,最后用無菌水沖洗3次,置于無菌濾紙上,吸干殘水備用[10]。將已消毒的種子研磨后加5 mL無菌水稀釋,吸取150 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,同時吸取150 μL洗滌水(消毒后第3次沖洗種子后的無菌水)為對照組檢驗表面消毒效果,涂布后置于37℃條件下培養(yǎng)72 h,每處理3組平行。待平板中長出菌落后,根據(jù)顏色、大小、形狀等的不同挑取單菌落平板劃線純化,將純化后得到的菌株編號,并斜面保存于4℃冰箱。

(2)沙棘種子內生細菌的形態(tài)鑒定

對分離純化得到的內生細菌菌株進行菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察,形態(tài)特征觀察主要參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]。

(3)沙棘種子內生細菌的分子鑒定

沙棘種子內生細菌DNA的提取采用堿裂法[12]。PCR擴增采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTA-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。反應體系為25 μL∶1 μL 27F,1 μL 1492R,15 μL Taq聚合酶,4 μL ddH2O,4 μL模板。反應條件：94℃ 2 min,94℃ 1 min,56℃ 30 s,72℃ 1 min；30個循環(huán),72℃ 2 min[13]。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。所得序列信息提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對,選取相似性最大的序列,用MEGA7.0軟件進行同源性分析,然后以鄰接法[14]構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2沙棘種子內生細菌的高通量測序

種子消毒處理同方法1.2.1。沙棘種子內生菌總DNA的提取采用CTAB法[15],以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度[16]。采用帶Barcode的特異引物擴增16S rDNA-V5區(qū)。擴增體系30 μL：Phusion Master Mix(2×)15 μL,Primer(2 μmol/L)3 μL,gDNA(1 ng/μL)10 μL,ddH2O 2 μL。反應程序：98℃ 1 min,98℃ 10 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環(huán)；72℃ 5 min,PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[17-18]。PCR擴增產物送北京諾禾致源科技股份有限公司,由Illumina Miseq測序儀進行高通量測序,首先對PCR產物進行混樣與純化,然后進行文庫構建和上機測序,測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data),存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(Dirty Data),為了使信息分析的結果更加準確、可靠,首先對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾,得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs聚類和物種分類。為研究各樣本的物種組成,對所有樣本的Effective Tags,以97%的一致性(Identity)進行OTUs聚類,然后對OTUs的代表序列進行物種注釋并進行生物學分析。

2 結果與分析

2.1 榆中縣中國沙棘種子內生細菌多樣性

2.1.1榆中縣中國沙棘種子內生細菌的純培養(yǎng)

(1)內生細菌的形態(tài)特征

從榆中縣中國沙棘種子中共分離得到4株內生細菌,編號分別為YZ1709B01、YZ1709B02、YZ1709B03、YZ1709B04。4株菌菌落表面均為濕潤光滑狀,菌落顏色呈乳白色,菌落形態(tài)為圓形或點狀。除菌株YZ1709B04為革蘭氏陰性菌外(圖1),其余3株菌均為革蘭氏陽性菌,其中,菌株YZ1709B01和YZ1709B03為桿狀菌,菌株YZ1709B02和YZ1709B04為球狀菌。

圖1 菌株YZ1709B04的形態(tài)特征

(2)內生細菌的16S rRNA基因序列分析

對純培養(yǎng)分離得到的內生細菌,提取其DNA后,PCR擴增其16S rRNA基因序列并進行測序分析,以鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。經16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明：4株中國沙棘種子內生細菌中,3株屬于厚壁菌門(Firmicutes),其中2株為芽孢桿菌屬(Bacillus),1株為葡萄球菌屬(Staphylococcus)。另外1株屬于變形菌門(Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)。

圖2 基于16SrRNA基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.2榆中縣中國沙棘種子內生細菌的高通量測序

提取榆中縣中國沙棘種子內生細菌總DNA,經檢測合格后,進行PCR擴增,擴增產物用于文庫構建和上機測序,然后基于有效數(shù)據(jù)對OTUs的代表序列進行物種注釋分析。

(1)樣品復雜度分析及OTUs數(shù)目統(tǒng)計

測序共得到71080條原始序列,經過濾后得到64452條有效序列,可分為147個OTUs。序列平均長度為368 bp,有效率為90.68%。從序列的分布長度來看,與16S rDNA-V5區(qū)序列長度大致吻合,表明測序數(shù)據(jù)量合理,可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

(2)內生細菌群落結構組成

經高通量測序后,選取相對豐度前10位的物種,在門和屬水平進行統(tǒng)計分析。從門水平看,沙棘種子內生細菌主要分布在7個菌門。由圖3可看出,內生細菌的主要優(yōu)勢門是藍藻門(Cyanobacteria),其相對豐度為95.62%。變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)在榆中縣沙棘種子中均有分布,相對豐度依次為2.03%、0.31%、0.22%、0.20%、0.01%和0.01%；其他門類的相對豐度合計為1.61%。

從屬水平看(圖3),榆中縣中國沙棘種子內生細菌的主要優(yōu)勢菌屬是藍細菌屬(Cyanobacteria)和貪噬菌屬(Variovorax),相對豐度分別為95.09%和0.63%。此外,甲基桿菌屬(Methylobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、氣單胞菌屬(Aureimonas)、紅樹桿菌屬(Mangrovibacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)和馬賽菌屬(Massilia)在沙棘種子中均有分布,相對豐度依次為0.27%、0.26%、0.19%、0.12%、0.11%、0.09%、0.08%和0.07%；其他菌屬的相對豐度合計為3.09%。

2.2 秦安縣中國沙棘種子內生細菌多樣性

2.2.1秦安縣中國沙棘種子內生細菌的純培養(yǎng)

(1)內生細菌的形態(tài)特征

從秦安縣中國沙棘種子中共分離得到5株內生細菌,編號分別為QA1709B01、QA1709B02、QA1709B03、QA1709B04和QA1709B05。5株菌菌落表面均為濕潤光滑狀,菌落顏色呈乳白色,菌落形態(tài)為圓形或點狀。除菌株QA1709B04為革蘭氏陰性菌外,其余4株菌均為革蘭氏陽性菌,且5株菌均為桿狀菌(圖4)。

圖4 菌株QA1709B01的形態(tài)特征

(2)內生細菌的16S rRNA基因序列分析

對純培養(yǎng)分離得到的內生細菌,提取其DNA后,PCR擴增其16S rRNA基因序列并進行測序分析,以鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。經16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明：5株中國沙棘種子內生細菌中,4株屬于厚壁菌門(Firmicutes),其中3株為芽孢桿菌屬(Bacillus),1株為葡萄球菌屬(Staphylococcus)。另外1株屬于變形菌門(Proteobacteria)的不動桿菌屬(Acinetobacter)。

圖5 基于16S rRNA基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2秦安縣中國沙棘種子內生細菌的高通量測序

提取秦安縣中國沙棘種子內生細菌總DNA,經檢測合格后,進行PCR擴增,擴增產物用于文庫構建和上機測序,然后基于有效數(shù)據(jù)對OTUs的代表序列進行物種注釋分析。

(1)樣品復雜度分析及OTUs數(shù)目統(tǒng)計

測序共得到82254條原始序列,經過濾后得到80073條有效序列,可分為75個OTUs,序列平均長度為372 bp,有效率為97.35%。從序列的分布長度來看,與16S rDNA-V5區(qū)序列長度大致吻合,表明測序數(shù)據(jù)量合理,可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

(2)內生細菌群落結構組成

經高通量測序后,選取相對豐度前10位的物種,在門和屬水平進行統(tǒng)計分析。從門水平看,沙棘種子內生細菌主要分布在5個菌門。由圖6可看出,內生細菌的主要優(yōu)勢門類是變形菌門(Proteobacteria),其相對豐度為91.68%。藍藻門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在秦安縣沙棘種子中均有分布,相對豐度依次為8.06%、0.04%、0.01%和0.01%；其他門類的相對豐度合計為0.20%。

從屬水平看(圖6),秦安縣中國沙棘種子內生細菌的主要優(yōu)勢菌屬是寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas),相對豐度為85.60%,其次是藍細菌屬(Cyanobacteria)和葉桿菌屬(Phyllobacterium),相對豐度為7.86%和5.28%。此外,代爾夫特菌屬(Delftia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia)、馬賽菌屬(Massilia)、嗜酸菌屬(Acidiphilium)在秦安縣中國沙棘種子中均有分布,相對豐度依次為0.24%、0.05%、0.03%、0.02%、0.01%、0.01%和0.01%；其他菌屬的相對豐度合計為0.88%。

圖6 秦安縣中國沙棘種子內生細菌在門和屬水平上的物種組成和相對豐度

2.3 榆中縣和秦安縣兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌多樣性比較

2.3.1內生細菌純培養(yǎng)的差異

純培養(yǎng)研究結果表明,從榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子中分離純化得到的內生細菌種類有一定的差異。其中,從榆中縣和秦安縣中國沙棘種子中分別分離純化得到4株和5株內生細菌(表2)。在門分類水平,榆中縣中國沙棘種子內生細菌中有3株屬于厚壁菌門,1株屬于變形菌門；而秦安縣中國沙棘種子內生細菌中有4株屬于厚壁菌門,1株屬于變形菌門。

表2 榆中縣和秦安縣兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌純培養(yǎng)的差異

在屬分類水平,榆中縣中國沙棘種子內生細菌中,厚壁菌門中2株屬于芽孢桿菌屬,1株屬于葡萄球菌屬；變形菌門的1株內生細菌為假單胞菌屬。而秦安縣中國沙棘種子內生細菌中,厚壁菌門中3株屬于芽孢桿菌屬,1株屬于葡萄球菌屬,變形菌門的1株內生細菌為不動桿菌屬?？梢?芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬細菌在兩種不同生境的中國沙棘種子中均有分布,而假單胞菌屬只分布于榆中縣中國沙棘種子中,不動桿菌屬只分布于秦安縣中國沙棘種子中。

2.3.2內生細菌高通量測序的差異

(1)內生細菌Alpha多樣性指數(shù)分析

在Alpha多樣性指數(shù)中,Chao1和ACE指數(shù)表示細菌群落的豐富度,值越大,群落豐富度越高。Shannon和Simpson指數(shù)表示細菌群落的多樣性程度,Shannon指數(shù)值越大,群落多樣性越高,而Simpson指數(shù)值越小,群落多樣性越高。從表3可以看出,榆中縣中國沙棘種子內生細菌的多樣性和豐富度均高于秦安縣。

表3 榆中縣和秦安縣兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌的Alpha多樣性指數(shù)差異

(2)內生細菌Venn圖分析

榆中縣和秦安縣兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌的Venn圖結果如圖7所示,從圖7可見,榆中縣中國沙棘種子內生細菌的OTUs總數(shù)為147個,特有OTUs為97個。秦安縣中國沙棘種子內生細菌的OTUs總數(shù)為75個,特有OTUs為25個,兩者共有的OTUs為50個。結果表明榆中縣中國沙棘種子內生細菌的種類明顯高于秦安縣中國沙棘種子內生細菌。

圖7 榆中縣和秦安縣中國沙棘種子內生細菌維恩圖

(3)內生細菌群落結構組成分析

高通量測序方法檢測到榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子內生細菌的多樣性存在明顯的差異。榆中縣中國沙棘種子中內生細菌包含7門、11綱、31目、44科和68屬,秦安縣中國沙棘種子內生細菌包含5門、7綱、17目、22科、30屬(表4)。

表4 各分類單元內生細菌的群落組成

從門分類水平看,榆中縣中國沙棘種子內生細菌主要分布在7個門(表5),秦安縣中國沙棘種子內生細菌主要分布在5個門。其中藍藻門為榆中縣中國沙棘種子內生細菌的主要優(yōu)勢門類,相對豐度為95.62%,變形菌門為秦安縣中國沙棘種子內生細菌的主要優(yōu)勢門類,相對豐度為91.68%。藍藻門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門在榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子中均有分布,但相對豐度存在差異。而梭桿菌門和異常球菌-棲熱菌門只分布于榆中縣中國沙棘種子中,相對豐度均為0.01%。

表5 榆中縣和秦安縣兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌在門水平上的差異

在屬分類水平,榆中縣中國沙棘種子內生細菌分布于68個屬,秦安縣中國沙棘種子內生細菌分布于30個屬,其中榆中縣中國沙棘種子特有的屬有37個。榆中縣中國沙棘種子內生細菌的主要優(yōu)勢屬為藍細菌屬,相對豐度為95.09%(表6),秦安縣中國沙棘種子內生細菌的主要優(yōu)勢屬為寡養(yǎng)單胞菌屬,相對豐度為85.60%。其中,在相對豐度前20的屬中,榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子共有的屬有13個；榆中縣中國沙棘種子特有的屬有7個,秦安縣中國沙棘種子特有的屬有7個。

表6 榆中縣和秦安縣兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌在屬水平上差異

3 討論

本研究采用純培養(yǎng)方法和高通量測序方法,分別對榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子內生細菌多樣性進行了研究。兩種方法均表明,兩種不同生境中國沙棘種子內生細菌多樣性存在一定的差異。

通過純培養(yǎng)方法,從榆中縣中國沙棘種子中分離得到了4株內生細菌,從秦安縣中國沙棘種子中分離得到了5株內生細菌。本實驗在進行種子內生菌分離時,只使用了細菌培養(yǎng)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,培養(yǎng)基種類相對單一,這可能是分離到的內生菌種類偏少的主要原因。本研究組前期使用相同培養(yǎng)基,曾對中國沙棘根瘤中的內生細菌進行過分離培養(yǎng),共得到17株內生細菌[8]。可見,同種植物的不同組織,采用相同的培養(yǎng)方法,可能會分離得到不同種類的內生菌,由于種子是受植物高度保護的封閉性的器官,導致內生細菌種類比其他植物器官要少。而時曉寒等[19]從白皮錦雞兒種子中分離得到32株內生細菌,與本實驗結果有一定差異,這可能是由于植物種類的不同,而導致所分離得到的可培養(yǎng)內生細菌的種類存在差異。在分離內生細菌時,培養(yǎng)條件對內生細菌的種類同樣存在一定的影響,不同生境的植物可為微生物提供適宜生存的環(huán)境和營養(yǎng)條件,且微生物群體與植物之間能行成復雜的共生關系,而實驗室無法完全模擬這種微生物所生存的自然生態(tài)環(huán)境,這也是所分離得到的內生細菌種類較少的原因之一[20]。因此,在分離沙棘種子內生細菌時,除優(yōu)化培養(yǎng)條件外,還應盡量模擬沙棘生存的自然生態(tài)環(huán)境,以獲得更多內生細菌資源,最大程度反映沙棘種子內生細菌的多樣性。

本研究通過高通量測序結果表明,在門分類水平,藍藻門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門在榆中縣和秦安縣兩種生境的中國沙棘種子中均有分布,但各門在兩地種子中的相對豐度卻存在明顯差異。有研究表明,藍藻門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門是植物內生細菌常見的優(yōu)勢門類[21-22],這說明不同生境的同一類植物,甚至是不同種類的植物,其內生細菌的物種組成在門水平上存在一定程度的相似性,但其相對豐度由于植株種類或生境的不同而有所差異,這與張芳芳等[23]的研究結果相一致。本研究中梭桿菌門和異常球菌-棲熱菌門只分布于榆中縣中國沙棘種子中,這主要由于榆中縣馬銜山年降水量與年均氣溫均優(yōu)于秦安縣王鋪鄉(xiāng),為內生細菌提供了適宜的生存環(huán)境。在屬分類水平上,貪噬菌屬、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、擬桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、葉桿菌屬、歐文氏菌屬和馬賽菌屬在榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子中均有分布,但相對豐度存在較大差異；可能是由于兩地中國沙棘生長的土壤類型、pH及含水量等因素差異較小,從而導致兩地中國沙棘種子內生細菌組成相似。而氣單菌屬、紅樹林桿菌屬、歐文氏菌屬、無桿菌屬、柔嫩梭菌屬和罕見小球菌屬只分布于榆中縣中國沙棘種子中；拜葉林克氏菌屬、雷爾氏菌屬、動球菌屬、阿菲波菌屬、成團泛菌屬、棍狀桿菌屬、梭菌屬只分布于秦安縣中國沙棘種子；可能是由于兩地海拔、年均降水量以及年均氣溫存在較大差異,從而導致內生細菌種類存在差異。

本文對榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子內生細菌的多樣性研究結果可知,榆中縣和秦安縣兩種不同生境的中國沙棘種子內生細菌均具有豐富的多樣性,且二者的多樣性存在一定差異,這可能是由于兩地海拔相差較大而造成的。有研究表明,由于海拔的差異會導致地區(qū)氣候特征及周圍植被的不同,造成植物種子內生菌的組成存在差異[24]；海拔越高,陽光照射越充足,適應高海拔環(huán)境的植物生長狀況越好,內生菌多樣性越豐富。所以不同海拔的植物,其內分布著不同的優(yōu)勢內生菌,且海拔差異越大,內生菌的物種組成相似度越低[25]。