紀(jì)鳳娣，夏 蓉，陶匯源，魏 巍，穆曉婷，李 東，魯 緋,

（1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

中國傳統(tǒng)食醋[1-2]，即谷物醋，是由大米、小麥、高粱、小米、麩皮等通過微生物發(fā)酵釀得[3]，是佐餐和烹飪中常用的一種液體酸味調(diào)味料[4]。鎮(zhèn)江香醋、山西陳醋、福建永春老醋和四川保寧醋等[5-6]是中國著名的具有獨(dú)特口感特征及感官品質(zhì)的地理標(biāo)志保護(hù)品牌的食醋。

有機(jī)酸是食醋中的一組重要化合物，它們不僅是具有特殊抑菌作用的功能性物質(zhì)[7-9]，也是能夠影響食醋感官特性的風(fēng)味物質(zhì)。有機(jī)酸的種類和含量最終影響食醋產(chǎn)品的穩(wěn)定性、色澤和風(fēng)味，也可以提供有關(guān)其來源以及加工和陳化工藝的信息[1]。因此，對食醋中有機(jī)酸構(gòu)成和含量的準(zhǔn)確了解可以為研究食醋生產(chǎn)工藝對其質(zhì)量的影響提供理論依據(jù)，能夠為食醋工業(yè)化生產(chǎn)和制造工藝標(biāo)準(zhǔn)化的推進(jìn)提供參考。

食醋中低分子質(zhì)量的有機(jī)酸分子極性強(qiáng)，雖然用滴定法定量總酸度相當(dāng)容易，但由于食醋基質(zhì)復(fù)雜，代謝產(chǎn)物種類繁多，大量的氨基酸、糖類和酚類化合物以及色素、鞣質(zhì)、無機(jī)鹽等的存在干擾分離和定量步驟，使對食醋中的單酸進(jìn)行提取和測定有一定的難度。值得注意的是，我國在食醋中有機(jī)酸的含量測定方面缺乏官方統(tǒng)一的分析方法。GB 2719—2018《食醋》僅規(guī)定總酸（以乙酸計）質(zhì)量濃度應(yīng)不小于3.5 g/100 mL，而GB 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測定》的適用范圍不包括食醋。目前，關(guān)于食醋中有機(jī)酸的分析方法有很多文獻(xiàn)報道，包括液相色譜（liquid chromatography，LC）法[10-19]、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[19]、氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法[20-22]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[23]和光譜法[24]。其中以分析速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好、應(yīng)用范圍廣的LC法對食醋中有機(jī)酸分離分析的研究報道最多。文獻(xiàn)報道的LC法[10-16]對有機(jī)酸的分析均采用C18色譜分離柱結(jié)合紫外檢測的方法。樣品預(yù)處理方法可分為2 種，第1種只對樣品進(jìn)行稀釋和過濾，第2種是樣品用離子交換樹脂或固相萃取柱萃取（如SAX陰離子交換萃取柱）以避免糖或色素與有機(jī)酸共溶的干擾，研究證實經(jīng)稀釋過濾后直接進(jìn)樣比固相萃取法具有更好的精密度和回收率[25]；余永健等[12-13]對采用C18色譜柱分離固態(tài)發(fā)酵食醋中9 種有機(jī)酸的LC分析法進(jìn)行了優(yōu)化；王潔等[17]采用Grace以樹脂聚合物為填料的有機(jī)酸專用分析柱對醋粉中的12 種有機(jī)酸進(jìn)行分離；Lin等[18]使用Rezex ROA苯乙烯和二乙烯基苯聚合樹脂（苯環(huán)有8%被磺化）填料的分析柱成功分離了20 種有機(jī)酸；Castro等[19]采用Ion 300離子排阻色譜柱對5 種有機(jī)酸進(jìn)行了分析。這些研究證明色譜柱的性能對分離復(fù)雜基質(zhì)中的多種有機(jī)酸至關(guān)重要。

本研究建立離子色譜法測定鎮(zhèn)江香醋及其相關(guān)產(chǎn)品中乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、酮戊二酸、草酸和檸檬酸的分析方法。采用Dionex Ion Pac AS11-HC分析柱（4 mm×250 mm）和KOH溶液梯度洗脫對上述14 種有機(jī)酸進(jìn)行分離，電導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測，方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高，適用于食醋及其相關(guān)衍生產(chǎn)品中14 種有機(jī)酸的測定。該方法為監(jiān)控食醋生產(chǎn)過程和相關(guān)產(chǎn)品中的有機(jī)酸含量提供技術(shù)手段，有益于食醋產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江香醋及制品由江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司提供。超純水為美國Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)制備。

L-乳酸（≥98%） 大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲酸鈉（≥99.0%） 美國Alfa Aesar公司；乙酸鈉（≥99.0%）、己二酸（≥99.5%）、丁二酸鈉（≥98%）、丙酮酸鈉（≥99.0%）和酮戊二酸（≥99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司；戊酸（≥99.3%）、草酸（≥99.8%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；丁酸（≥99.0%）、丙酸（≥99.0%）上海麥克林生化科技有限公司；異戊酸（≥99.6%）北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；L-酒石酸（≥98.0%）北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸（≥97.0%） 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-5000＋離子色譜儀（配有AS-AP智能樣品處理系統(tǒng)、自動淋洗液發(fā)生器和抑制電導(dǎo)檢測器，抑制器型號AERS 500_4mm）和Chromeleon 7.1色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Dionex OnGuardTMII RP Cartridges（1 mL）固相萃取柱、Dionex Ion Pac AS11-HC分析柱（4 mm×250 mm）、Dionex Ion Pac AS11-HC保護(hù)柱（4 mm×50 mm） 美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CF16RX高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；MX-F渦旋混合器 北京聯(lián)合科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取混合均勻的食醋樣品0.5 g至50 mL容量瓶中，加水40 mL左右，于35 ℃超聲10 min，充分溶解后冷卻至室溫，加水定容至刻度，混勻；樣品在8 000 r/min離心10 min后，取一定體積的上清液，過0.22 μm水相濾膜，濾液備用（根據(jù)含量確定樣品稀釋倍數(shù)）；對于顏色較深的樣品，濾液可以采用Dionex OnGuardTMII RP Cartridges（1 mL）固相萃取柱進(jìn)行凈化處理（凈化柱使用前依次用4 mL甲醇，6 mL水進(jìn)行活化，放置30 min后使用）。將上述濾液通過凈化柱，棄去前面3 倍柱體積洗脫液，收集后面的洗脫液待上機(jī)測定。

分別準(zhǔn)確稱取乳酸、乙酸鈉、丙酸、甲酸鈉、丁酸、丙酮酸鈉、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸鈉、酒石酸、酮戊二酸、草酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品約0.01 g（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，混勻。儲備液質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL。分別吸取一定體積的上述14 種有機(jī)酸儲備溶液于容量瓶中，用水配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.3.2 色譜條件

Dionex Ion Pac AS11-HC分析柱（4 mm×250 mm）和Dionex Ion Pac AS11-HC保護(hù)柱（4 mm×50 mm）；流動相：KOH梯度洗脫，流動相梯度見表1；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；檢測器：電導(dǎo)檢測器；抑制器：AERS500（4 mm）；抑制器電流167 mA。根據(jù)保留時間定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

表1 流動相梯度Table 1 Elution gradient of mobile phase

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取一定體積的100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液于容量瓶中，用水配制成0、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。按照1.3.2節(jié)的色譜條件進(jìn)行分析，以有機(jī)酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作圖，進(jìn)行線性回歸分析和樣品定量分析。

1.3.4 樣品加標(biāo)回收率的測定

準(zhǔn)確稱取0.5 g白醋樣品18 份，1～6號樣品加入2 500 μg的有機(jī)酸，7～12號樣品加入5 000 μg的有機(jī)酸，13～18號樣品加入25 000 μg的有機(jī)酸，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，再按照1.3.2節(jié)色譜條件測定，計算回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 8.6軟件進(jìn)行圖形繪制，采用Chromeleon 7.1色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相梯度的優(yōu)化

離子色譜是基于離子色譜柱（離子交換樹脂）上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進(jìn)行的可逆交換和分析物溶質(zhì)對交換劑親和力的差別而被分離的。由于在溶液中大多數(shù)電離物質(zhì)都會電離，因此可以通過測定電導(dǎo)值檢測被測物質(zhì)的含量。本研究采用低選擇性的KOH淋洗液[26]和AS11-HC陰離子分離柱，樣品測試溶液進(jìn)樣之后，有機(jī)酸陰離子首先與分離柱的離子交換位點之間直接進(jìn)行離子交換（即被保留在柱上），然后被淋洗液中的OH-置換并從柱上被洗脫，對樹脂親和力弱的分析物離子先于對樹脂親和力強(qiáng)的分析物離子依次被洗脫。乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、酮戊二酸、草酸、檸檬酸在稀溶液中會完全電離，產(chǎn)生電導(dǎo)，采用電導(dǎo)檢測器可以分析其含量。

考察KOH淋洗液質(zhì)量濃度變化對14 種有機(jī)酸分離的影響。經(jīng)過淋洗液質(zhì)量濃度、分離時間的優(yōu)化和分離效果的比較，確定的淋洗液梯度見表1。在優(yōu)化后的色譜條件下，35 min內(nèi)可以實現(xiàn)14 種有機(jī)酸的完全分離，如圖1所示。14 種有機(jī)酸完全達(dá)到基線分離。

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of organic acids

2.2 樣品處理方法的選擇

圖2 樣品測試液色譜圖Fig.2 Chromatograms of tested samples

采用樣品直接稀釋的方法對食醋樣品進(jìn)行處理。食醋發(fā)酵過程中微生物的代謝不僅產(chǎn)生多種低分子質(zhì)量的有機(jī)酸，還產(chǎn)生了一些其他的大分子化合物，如肽類和多糖類化合物[27-28]。因此，在處理過程中采用高速離心的方式去除一些高分子質(zhì)量化合物可以避免它們對測定過程的干擾。另外，樣品所含的有機(jī)酸中，乳酸和乙酸的含量遠(yuǎn)高于其他的有機(jī)酸（如丁二酸和檸檬酸等），為了能夠準(zhǔn)確定量，根據(jù)樣品中乙酸的含量將其稀釋不同的倍數(shù)測定，用稀釋倍數(shù)大的測試樣品對乳酸和乙酸進(jìn)行定量（如稀釋50 倍或100 倍等），用稀釋倍數(shù)?。ㄈ缦♂?0 倍或10 倍等）的測試樣品對其他有機(jī)酸進(jìn)行定量。對稀釋后顏色仍然較深的樣品，可以采用Dionex OnGuardTMII RP Cartridges（1 mL）固相萃取柱去除其中的色素。

如圖2A所示，16.543 min為Cl-的色譜峰，31.921 min為PO43-的色譜峰。如圖2B所示，樣品稀釋倍數(shù)為10 倍時，乳酸和乙酸色譜峰分離度差，峰形變差，定量準(zhǔn)確性差，而稀釋倍數(shù)為50 倍的測試樣品乳酸和乙酸色譜峰分離度好，定量準(zhǔn)確性高。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和精密度結(jié)果

分別將不同質(zhì)量濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（圖1）。以有機(jī)酸質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸方程見表2。有機(jī)酸的質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的相關(guān)性。以10 μg/mL有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣8 次進(jìn)行精密度實驗，14 種有機(jī)酸測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）結(jié)果在0.015%～0.032%范圍內(nèi)，表明精密度滿足方法學(xué)定量的要求。根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》對檢出限和定量限的規(guī)定，以3 倍的信噪比確定檢出限（0.001～0.09 μg/mL），以10 倍的信噪比確定定量限（0.005～0.3 μg/mL），結(jié)果見表2。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性結(jié)果

對方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行考察，選擇白醋樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，白醋樣品中僅含有乙酸4.7%。在優(yōu)化后的實驗條件下，分別對有機(jī)酸添加量為2 500、5 000 μg和25 000 μg的樣品進(jìn)行測定，樣品前處理方式采用直接稀釋的方式，見表3，將有機(jī)酸添加量為25 000 μg的樣品稀釋后采用固相萃取柱凈化，見表4。圖3為白醋樣品本底和加標(biāo)樣品的色譜圖。不使用固相萃取柱凈化時，14 種有機(jī)酸的平均回收率為94.7%～105%；使用萃取柱凈化時，丙酸的回收率為72.6%，丁酸的回收率只有1.1%，異戊酸和戊酸的回收率為0%，即短鏈脂肪酸的回收率隨碳原子數(shù)的增加而降低。

表3 直接稀釋的預(yù)處理方式回收率實驗結(jié)果Table 3 Recoveries with direct dilution pretreatment

表4 樣品稀釋后采用固相萃取柱凈化回收率實驗結(jié)果Table 4 Recoveries with sample dilution followed by solid phase extraction cleanup

圖3 樣品和加標(biāo)樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples and spiked samples

2.5 樣品中有機(jī)酸含量

表5 樣品中有機(jī)酸含量Table 5 Contents of organic acids in real samples%

醋膏及醋粉均為鎮(zhèn)江香醋的加工制品，其中醋膏由鎮(zhèn)江香醋采用真空濃縮而成，醋粉則是由鎮(zhèn)江香醋添加麥芽糊精等輔料后，經(jīng)過噴霧干燥而得的產(chǎn)品。由表5可知，鎮(zhèn)江香醋、醋膏及醋粉中檢出的有機(jī)酸種類一致，醋膏中乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)10.1%，說明乳酸作為醋中含量比較穩(wěn)定的有機(jī)酸，經(jīng)過濃縮后，含量顯著升高。本方法適用于食醋及其加工衍生品中有機(jī)酸的測定。

3 結(jié) 論

分析影響食醋風(fēng)味品質(zhì)的有機(jī)酸構(gòu)成和含量對產(chǎn)品品質(zhì)評價和質(zhì)量提升意義重大。本研究建立測定食醋及其相關(guān)產(chǎn)品中有機(jī)酸的離子色譜法。采用AS11-HC陰離子色譜柱分離，以KOH溶液梯度淋洗的方式對食醋中包括乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、丁酸、丙酮酸、異戊酸、戊酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、酮戊二酸、草酸和檸檬酸的14 種有機(jī)酸進(jìn)行分離，流動相流速1.5 mL/min，電導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測。方法重復(fù)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，直接稀釋法回收率在94.7%～105%范圍內(nèi)，檢出限為0.001～0.09 μg/mL，定量限為0.005～0.3 μg/mL。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該分析方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，樣品處理也比較簡便，適用于食醋及其相關(guān)制品中14 種有機(jī)酸的含量測定，可以作為有效控制食醋及相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)，為相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)評價、標(biāo)準(zhǔn)的完善和提升提供了技術(shù)支撐。