王曉月，張珊珊，張欣珂，曹 鵬，張 波，何 非,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

顏色是紅葡萄酒最直觀的感官屬性，一方面能夠反映原料和釀造工藝的優(yōu)劣，另一方面也是消費者選購時重要的參考指標[1]。紅葡萄酒中主要的呈色化合物是花色苷，它的組成和含量影響葡萄酒的色澤特征[2-3]。但花色苷較不穩(wěn)定，尤其是單體花色苷，在發(fā)酵、陳釀以及貯存過程中易受到光照、溫度變化等環(huán)境因素的影響而發(fā)生降解[4-5]，從而影響顏色品質(zhì)。因此，提升紅葡萄酒顏色品質(zhì)與顏色穩(wěn)定性一直是葡萄酒領域關(guān)注和研究的重點。目前，利用葡萄酒的“輔色作用”改善顏色品質(zhì)是一種新穎、科學、經(jīng)濟且綠色安全的方法[6]，花色苷分子與輔色素通過“π-π”疏水堆疊作用形成結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的復合體，使花色苷在可見光譜區(qū)的光吸收增強，最大吸收波長向長波長方向移動，產(chǎn)生紅移效應，這個現(xiàn)象稱為輔色作用[7]，在葡萄酒中表現(xiàn)為色澤增強，釀造過程中色澤的穩(wěn)定性提高。研究表明，在新鮮紅葡萄酒中輔色作用產(chǎn)生的復合物大約貢獻了30%～50%的顏色總量[7]。常見輔色素有：有機酸、氨基酸、核苷酸、金屬離子、生物堿以及多酚等[8]，在紅葡萄酒中，黃酮醇、酚酸等酚類物質(zhì)是輔色素的主要來源。

黃酮醇是葡萄酒中重要的酚類物質(zhì)，主要包括楊梅酮、山柰酚和槲皮素等，多以糖苷態(tài)的形式存在，雖然自身不表現(xiàn)紅色，卻能夠與葡萄酒中的花色苷類物質(zhì)發(fā)生輔色作用，對維持葡萄酒顏色的鮮艷飽滿有重要的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在pH 3.5的反應體系下，槲皮素可與花色苷形成穩(wěn)定性較高的色素復合體，并產(chǎn)生28 nm的紅移變化[10]。Lambert等[11]在模擬紅葡萄酒體系中添加黃酮醇和咖啡酸后發(fā)現(xiàn)顏色穩(wěn)定性提高41%，色度增加46%。此外，在過去的幾十年里，國內(nèi)外研究者進行了許多有關(guān)輔色素的添加實驗：向發(fā)酵液中添加兒茶素和咖啡酸[12]；發(fā)酵前添加蘆丁和香豆酸[13]；浸漬時添加沒食子酸和鞣花酸[14]；釀造過程中添加葡萄梗[15]和葡萄籽[16-17]等。這些研究結(jié)果證實，通過在發(fā)酵或陳釀時期添加輔色素，產(chǎn)生的輔色作用可以在一定程度上改善紅葡萄酒的色度色調(diào)，并提高酒體顏色的穩(wěn)定性。

相比于其他酚類物質(zhì)，黃酮醇是較為理想的輔色素[18]，但由于受各種因素影響，紅葡萄酒中黃酮醇類化合物含量較低，且隨著陳釀的進行不斷下降[19]，因此在一定程度上限制了其對于紅葡萄酒顏色穩(wěn)定性的貢獻。此外，目前關(guān)于黃酮醇對葡萄酒的輔色作用研究多是在模擬紅葡萄酒體系中或者小規(guī)模的釀造過程中進行，能夠真正應用和指導實際釀造的研究較少。因此，本實驗通過在發(fā)酵前外源添加楊梅酮、山柰酚和槲皮素3 種黃酮醇類輔色素，探究其輔色作用、釀造過程中引起的顏色品質(zhì)和多酚組成的變化，以及長時間陳釀過程中其對顏色的保護作用，以期為葡萄酒釀造過程中黃酮醇類輔色素的應用提供一定的科學依據(jù)，并對實際生產(chǎn)提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’（Vitis viniferaL.‘Cabernet Sauvignon’）葡萄果實，于2014年采摘自寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭山東麓張裕摩塞爾十五世酒莊葡萄生產(chǎn)基地（106.11°E，38.45°N），并在此地進行葡萄酒釀造。

乙醛、亞硫酸、無水乙醇、氯化鈉（均為分析純）北京化工廠；酒石酸（分析純） 天津市津科精細化工研究所；乙腈、甲醇、乙酸、甲酸（均為色譜純）美國Fisher公司；實驗用水采用Milli-Q純化水系統(tǒng)制得；楊梅酮、山柰酚、槲皮素（均為食品級，純度＞95%）陜西慈緣生物科技有限公司；花色苷標準品（甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷）法國Extrasynthese公司；非花色苷酚類物質(zhì)標準品（原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基肉桂酸） 美國Sigma-Aldrich公司；商業(yè)酵母（Lalvin clos）、商業(yè)乳酸菌（Oenococcus oeni31 Lalvin） 加拿大Lallemand公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；1100系列高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀、1200系列高效液相色譜-6410B系列三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、Poroshell 120 EC-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）美國安捷倫科技有限公司；Kro-masil100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，6.5 μm） 瑞典阿克蘇諾貝爾公司；LX-X5震動式除梗一體機 新鄉(xiāng)市領先輕工機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒發(fā)酵

葡萄果實在商業(yè)成熟后采收，去除霉爛果、葉片及生青果，經(jīng)震動式除梗一體機除梗，再將充分成熟且健康的葡萄果實經(jīng)機械破碎后，置于10 000 L不銹鋼發(fā)酵罐（裝填量為80%體積），向破碎后的葡萄醪液中添加60 mg/L SO2。于4 ℃條件下冷浸漬84 h后，向不同的發(fā)酵罐中分別添加楊梅酮、山柰酚和槲皮素，根據(jù)文獻報道的輔色素最適添加比例和3 種輔色素的溶解度[7,20]，將添加量分別設為170、200 mg/L和150 mg/L，對照組不作任何添加。對照和3 種添加處理各有3 個生物學平行。隨后，接入0.25 g/L的商業(yè)酵母啟動乙醇發(fā)酵，期間溫度控制在24～26 ℃范圍內(nèi)，每日進行3 次壓帽循環(huán)操作，并每6 h左右測定溫度、密度；乙醇發(fā)酵結(jié)束后接入商業(yè)乳酸菌Oenococcus oeni啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵，每周定期測定蘋果酸、乳酸變化情況。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后皮渣分離，加入60 mg/L SO2之后分別置入225 L的橡木桶中進行周期12 個月的桶儲，隨后裝瓶，繼續(xù)進行12 個月的瓶儲[16,21]。

根據(jù)發(fā)酵工藝，分別在乙醇發(fā)酵開始（冷浸漬結(jié)束）、乙醇發(fā)酵結(jié)束、蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束、桶儲12 個月和瓶儲12 個月時取樣，每個取樣點取樣量為300 mL×3，取樣后迅速置于-20 ℃冰箱保存，待測。

1.3.2 理化指標分析

葡萄酒乙醇體積分數(shù)、總糖、總酸、揮發(fā)酸和SO2等參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定，使用pH計直接測定pH值，所有測定重復3 次。

1.3.3 花色苷的檢測

采用高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀進行花色苷的檢測[22]，酒樣測定前經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾。色譜柱型號Kromasil 100-5 C18；流動相A為水-甲酸-乙腈（92∶2∶6，V/V）；流動相B為水-甲酸-乙腈（44∶2∶54，V/V）。洗脫程序：0～18 min，90%～75% A，10%～25% B；18～20 min，75% A，25% B；20～30 min，75%～60% A，25%～40% B；30～35 min，60%～30% A，40%～70% B；35～40 min，30%～0% A，70%～100% B。流速1.0 mL/min，進樣量30 μL，柱溫50 ℃，檢測波長525 nm。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，正離子模式，掃描范圍：m/z100～1 000；霧化器壓力35 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃。

依據(jù)本實驗室建立的花色苷譜庫，通過比對譜庫中的質(zhì)譜、光譜信息和保留時間進行定性。用各種花色苷標準品進行外標法定量，建立質(zhì)量濃度為5～500 mg/L之間9 個水平、3 個重復的標準曲線，線性回歸系數(shù)在0.999以上，所有花色苷均以對應單體花色苷質(zhì)量濃度計算。

1.3.4 非花色苷酚的檢測

采用高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測非花色苷酚[23]，樣品測定前經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾。色譜柱型號Poroshell 120 EC-C18；流動相A為水，流動相B為甲醇-乙腈（50∶50，V/V），A和B相都加了0.1%甲酸。洗脫程序：0～28 min，90%～54% A，10%～46% B；28～29 min，54%～90% A，46%～10% B；后運行程序5 min，流速0.4 mL/min，進樣量5 μL，柱溫55 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，負離子模式，噴霧電壓4 kV，離子源溫度150 ℃，干燥氣溫度350 ℃，流量12 L/h，霧化器壓力35 psi，檢測器為選擇離子檢測模式。樣品的定性定量方法與1.3.3節(jié)花色苷方法類似。

1.3.5 輔色、游離及聚合花色苷比率的測定

參照Boulton[7]方法測定酒樣中輔色、游離及聚合花色苷的比率。取2 mL酒樣并調(diào)節(jié)其pH 3.60，加入20 μL 10%乙醛溶液，反應45 min；利用模擬葡萄酒溶液（12%乙醇溶液加入5 g/L酒石酸和0.2 mol/L氯化鈉，并調(diào)節(jié)pH 3.60）稀釋酒樣20 倍；另取2 mL供試酒樣，加入160 μL 6% SO2進行反應。測定以上3 種處理的酒樣在520 nm波長處的吸光度，分別記為A0、A1、A2。樣品中各比率計算如下：

1.3.6 CIELab顏色空間測定

采用CIELab顏色評價系統(tǒng)進行顏色分析，以參數(shù)L*、a*、b*表示葡萄酒顏色的色度和色調(diào)。其中，L*反映葡萄酒的亮度值（L*=0，黑色；L*=100，無色），與顏色深淺呈負相關(guān)；＋a*/-a*分別表示紅色和綠色色調(diào)，＋b*/-b*分別表示黃色和藍色色調(diào)，a*和b*值均與色調(diào)多少呈正相關(guān)[2]，顏色差異用ΔE*表示。

以蒸餾水為空白對照，酒樣經(jīng)0.45 μm水系膜過濾，選擇2 mm光徑玻璃比色皿，利用紫外-可見分光光度計分別測定其在440、530 nm和600 nm波長處的吸光度，純水作為對照，計算各供試樣品的CIELab參數(shù)，并用處理組與對照組的L*、a*、b*值計算ΔE*值[24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個處理重復3 次，采用Microsoft Office 2007 Excel軟件對數(shù)據(jù)進行計算，結(jié)果以±s表示，并用SPSS 20.0（Chicago，IL，USA）軟件進行ANOVA分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒基本理化指標

表1 葡萄醪及葡萄酒中常規(guī)理化指標Table 1 Physicochemical parameters of musts and red wines

如表1所示，發(fā)酵前葡萄醪和發(fā)酵后葡萄酒理化指標的測定結(jié)果均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》對干紅葡萄酒的質(zhì)量要求。發(fā)酵前葡萄醪的總糖和總酸含量說明樣品具有良好的成熟度，發(fā)酵后的各樣品總糖質(zhì)量濃度均低于4 g/L，乙醇體積分數(shù)在12%以上，符合干紅葡萄酒的基本要求。此外，總酸質(zhì)量濃度在5.90～6.20 g/L之間，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度低于1.0 g/L，說明各處理在整個發(fā)酵過程中工藝操作控制一致，并且衛(wèi)生管理滿足生產(chǎn)要求。SO2含量及pH值等方面均符合國家標準對于干紅葡萄酒的規(guī)定。對于葡萄酒中關(guān)鍵的理化指標如總糖、總酸、pH值，添加輔色素后并不會對其造成顯著影響，綜上，不同組的總體情況滿足后續(xù)分析測定的基本要求。

2.2 添加黃酮醇輔色素對顏色的影響

圖1 處理組和對照組在發(fā)酵和陳釀過程中顏色參數(shù)Fig.1 Color parameters in experimental and control groups during winemaking and aging

由圖1可知，經(jīng)過發(fā)酵和陳釀后，對照組和不同處理組的L*、a*、b*值都發(fā)生了明顯的變化。在發(fā)酵過程中，隨著葡萄中花色苷與非花色苷酚類物質(zhì)浸出，L*值逐漸下降，a*值升高，乙醇發(fā)酵結(jié)束為最值點；在陳釀過程中，L*值先持續(xù)上升后略微下降，a*值下降；而b*值在不同的階段均呈現(xiàn)上升趨勢。在整個發(fā)酵和陳釀過程，總體視覺效果表現(xiàn)為酒體顏色加深，黃色色調(diào)顯著增多，顏色更加飽滿。

從圖1可得，4 組樣品具有類似的顏色變化趨勢，但黃酮醇類物質(zhì)處理組顯示出更好的顏色。在蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時，楊梅酮、山柰酚和槲皮素處理組比對照組的L*值分別低了9.03%、5.03%、4.11%，具有顯著性差異（P＜0.05）；而a*值分別高出8.65%、3.86%和0.86%，楊梅酮處理組與對照組具有顯著性差異（P＜0.05）；處理組的b*值高出對照組89.92%、83.21%和130.22%，有更多的黃色色調(diào)。添加輔色素后顏色更深、紅色色調(diào)更多，適宜的黃色調(diào)也可以使酒體更加鮮艷飽滿[25]，這說明輔色素在發(fā)酵過程對提升酒體顏色具有一定的積極作用。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時，處理組能夠觀察到明顯的色差，不同組的色差值ΔE*分別為7.1（楊梅酮）、4.19（山柰酚）和4.31（槲皮素），當ΔE*值大于2.7時人眼就能辨別出差異[26]。

在陳釀過程中，各組L*值升高、a*值降低，酒體顏色由鮮艷的紫紅色和寶石紅逐漸向瓦紅和磚紅色轉(zhuǎn)變，這主要是葡萄酒中花色苷類物質(zhì)會發(fā)生一定程度的氧化降解或者衍生而導致酒體紅色色調(diào)的損失[27-28]。另外b*值不斷升高，可能是由于具有橙/黃色色調(diào)的吡喃花色苷[29]逐漸形成。從圖1可知，桶儲12 個月時，楊梅酮、山柰酚處理組具有相對較低的L*值和較高的a*值，同時處理組b*值的升高速度明顯小于對照組；瓶儲12 個月時，處理組的a*值均顯著高于對照組（P＜0.05），紅色色調(diào)更多，楊梅酮、槲皮素處理組L*值更低，顏色更深。已有研究表明，發(fā)酵前添加黃酮醇類化合物而引起的輔色反應，在一定程度上能緩解酒體在陳釀期間顏色色度的淺化現(xiàn)象[10]。無論是桶儲還是瓶儲12 個月，楊梅酮處理組都有明顯的色差（ΔE*＞2.7），具有相對較好的顏色表現(xiàn)。

2.3 添加黃酮醇輔色素對干紅葡萄酒中花色苷輔色效應的影響

圖2 處理組和對照組在發(fā)酵和陳釀過程中葡萄酒輔色化率的變化Fig.2 Co-pigmentation ratio in experimental and control groups during winemaking and aging

干紅葡萄酒中的花色苷一般以輔色、游離以及聚合3 種形式存在，其對于酒的顏色具有重要作用，圖2為不同階段輔色花色苷比率、游離花色苷比率和聚合花色苷比率的變化。對于輔色花色苷比率，在發(fā)酵階段總體沒有明顯變化。發(fā)酵起始時，槲皮素處理組的輔色花色苷比率低于對照組，但其他處理組與對照之間沒有顯著性差異（P＞0.05）；而乙醇發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時，楊梅酮處理組都顯著高于對照組的輔色花色苷比率（P＜0.05），但山柰酚、槲皮素處理組并沒有較高的比率，因此在發(fā)酵過程中添加楊梅酮的處理組具有更強的輔色能力，這可能與它們的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)差異有關(guān)[18]。桶儲12 個月后4 組樣品的輔色花色苷比率均略有升高，有效的 “花色苷-輔色素”復合物的形成，對干紅葡萄酒顏色具有重要的保護作用[30]。但在瓶儲12 個月后輔色花色苷比率平均下降了34.98%，楊梅酮、山柰酚處理組的輔色化率顯著高于對照處理，這說明所添加的黃酮醇類化合物表現(xiàn)出了一定的輔色作用，但輔色作用會隨著陳釀時間的延長而逐漸減弱[31]。同時推測在瓶儲后期，酒體中的花色苷向更大分子質(zhì)量的聚合花色苷衍生物轉(zhuǎn)變。

在瓶儲前的不同階段，游離花色苷比率均呈不斷下降趨勢，這是由于紅葡萄酒中游離態(tài)花色苷的性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化、降解或聚合等反應而逐漸減少[32]。如圖2所示，在蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時，楊梅酮、槲皮素處理組的游離花色苷比對照組分別低41.77%、15.91%，表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。桶儲階段大量游離花色苷的降解以及復雜的反應使其比率急劇下降，隨后在瓶儲階段游離花色苷比率有所回升，可能是長時間陳釀后形成的輔色復合物中的花色苷游離或分解出來。在發(fā)酵和陳釀整個過程中處理組的游離花色苷含量整體低于對照組，分析是由于酒體中游離花色苷與添加的黃酮醇類化合物形成了更多的“花色苷-黃酮醇”復合物[33]，更多的花色苷處于輔色狀態(tài)，從而影響了酒體中游離花色苷比率。

聚合色素是由酒中花色苷和其他物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)變生成的，具有抗水化和抗SO2漂白的能力，因而表現(xiàn)出較強的顏色穩(wěn)定性[34]。在整個過程中，聚合花色苷比率呈明顯上升趨勢，結(jié)合在此期間輔色化率的變化趨勢，分析這與輔色反應形成的輔色復合物有關(guān)，有研究表明輔色作用可能是形成聚合色素的第一步，這些聚合色素對陳釀型紅葡萄酒的顏色穩(wěn)定起著重要的作用[35]。

2.4 添加黃酮醇輔色素對干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)的影響

為更全面地了解發(fā)酵前添加黃酮醇輔色素對葡萄酒品質(zhì)的影響，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對實驗樣品的酚類物質(zhì)進行檢測，共鑒定出19 種花色苷類物質(zhì)（包括4 種單體花色苷、8 種?；ㄉ?、7 種吡喃型花色苷）和32 種非花色苷酚類物質(zhì)（包括黃烷醇類8 種、黃酮醇類17 種、羥基肉桂酸類2 種、羥基苯甲酸類5 種）。

圖3 處理組和對照組在發(fā)酵和陳釀過程中不同種類花色苷含量變化Fig.3 Contents of anthocyanins in experimental and control groups during winemaking and aging

對于花色苷類物質(zhì)，在發(fā)酵階段，其含量大幅度升高并在乙醇發(fā)酵結(jié)束時達到峰值，這是由于果皮和果肉中的酚類物質(zhì)不斷浸提到酒中。蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時，與冷浸漬結(jié)束（乙醇發(fā)酵開始）時相比較，對照組總花色苷含量升高了70%，而添加楊梅酮、山柰酚和槲皮素的3 個處理組總花色苷的含量分別升高了151%、101%、106%，升高量顯著高于對照組（P＜0.05）。輔色素的添加能夠改變花色苷在固液之間的浸漬平衡，形成的輔色復合體加速平衡向液相移動從而更有利于花色苷類物質(zhì)的浸出[14]。從圖3可以看出，4 組樣品非酰化、酰化花色苷含量的變化趨勢均與總花色苷含量的變化趨勢相同，乙醇發(fā)酵結(jié)束時，楊梅酮處理組的單體、?；瓦拎ㄉ蘸烤@著高于對照組（P＜0.05），表現(xiàn)出很好的促進花色苷浸提效果。在陳釀階段，隨著時間的延長，葡萄酒中單體花色苷逐漸減少并最終從酒中消失，取而代之的是一些吡喃花色苷等花色苷衍生物，吡喃花色苷如vitisin A和vitisin B通常在乙醇發(fā)酵中后期產(chǎn)生，在陳釀最初的幾個月達到峰值，隨后下降[36-37]。本實驗中陳釀12 個月后吡喃花色苷含量較陳釀之前顯著性降低，說明此時已經(jīng)過了峰值點。本實驗測得的吡喃花色苷有4-丙酮酸二甲花翠素及其乙?；苌?、4-乙醛二甲花翠素單葡萄糖苷及其乙酰化和香豆?；苌?、4-乙烯苯酚二甲花翠素單葡萄糖苷及其乙?；苌铮@些吡喃型花色苷能使酒體呈現(xiàn)出橙紅/黃色調(diào)[38]，并具有較強的穩(wěn)定性。由圖3可看出，陳釀后期處理組和對照組中單體、?；ㄉ盏暮繘]有明顯差別，而在桶儲和瓶儲12 個月時，處理組中吡喃花色苷的含量均低于對照組，說明黃酮醇類輔色素的添加并沒有減緩干紅葡萄酒在陳釀期間花色苷含量的降低，這可能與陳釀時間有關(guān)，陳釀時間越久，花色苷和輔色素的含量越低，輔色效應也逐漸減弱[31]。Gutiérrez等[39]研究發(fā)現(xiàn)，對于新釀造的來自西班牙的‘丹魄’、‘赤霞珠’和‘西拉’葡萄酒，輔色化程度大約占32%～45%，但這一程度隨陳釀時間的延長而逐漸下，陳釀9 個月后，輔色化程度基本消失（0%～5%）。

圖4 處理組和對照組在發(fā)酵和陳釀過程中非花色苷酚類物質(zhì)含量變化Fig.4 Contents of non-anthocyanin phenolics in experimental and control groups during winemaking and storage

對于非花色苷酚類物質(zhì)，由圖4可知，在發(fā)酵階段，黃烷醇總含量呈上升趨勢。乙醇發(fā)酵結(jié)束時，楊梅酮、山柰酚、槲皮素處理黃烷醇含量比對照組分別高出11.65%、4.15%、1.17%；蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時處理組的黃烷醇總量也高于對照組，說明輔色素處理在一定程度上有利于酒中黃烷醇的浸出。黃酮醇類物質(zhì)在發(fā)酵期間的變化趨勢與花色苷相似，蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束時楊梅酮、山柰酚、槲皮素處理組的黃酮醇含量分別高出對照組32.22%、14.40%、17.29%，具有顯著性差異（P＜0.05）。同時，羥基苯甲酸和羥基肉桂酸這兩類酚酸的含量在發(fā)酵階段持續(xù)增加，發(fā)酵結(jié)束時處理組比對照組的總酚酸含量平均高出13.31%。研究表明羥基肉桂酸或其脫羧產(chǎn)物可與花色苷共價反應形成吡喃花色苷，從而有利于維持紅葡萄酒的顏色穩(wěn)定性。陳釀階段，4 組樣品的非花色苷酚類含量不斷減少，處理組的黃酮醇、黃烷醇和酚酸類物質(zhì)含量均高于對照組，較多的非花色苷酚有助于陳釀期間葡萄酒顏色穩(wěn)定。

2.5 顏色與輔色、游離和聚合花色苷比率之間的相關(guān)性分析

圖5 基于Pearson相關(guān)性分析的CIELAB參數(shù)、游離、輔色和聚合花色苷比率的聚類熱圖Fig.5 Clustered correlation heatmap between CIELAB color parameters and free, co-pigmented and polymeric anthocyanin ratio based on Pearson correlation analysis

為進一步分析葡萄酒顏色與輔色、游離和聚合花色苷比率之間的關(guān)系，將蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束和瓶儲12 個月的CIELab顏色參數(shù)與輔色花色苷比率、游離花色苷比率和聚合花色苷比率進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果以熱圖展現(xiàn)，顏色從紅色到藍色變化，表示從強的正相關(guān)性到強的負相關(guān)性變化。由圖5可看出，a*值與輔色花色苷比率有較顯著的正相關(guān)性，L*、b*值與輔色花色苷比率呈負相關(guān)，因為輔色花色苷比率值越大，處于輔色化狀態(tài)的花色苷越多，則貢獻的紅色色調(diào)越多[20,40]，顏色越深，則a*值越大、L*值越小。也說明一定的輔色作用有利于顏色的表現(xiàn)，具有一定的增色效應，與之前的研究結(jié)果一致[14]。a*值與聚合花色苷比率有顯著負相關(guān)性，b*值與聚合花色苷比率有顯著正相關(guān)性，這主要是因為聚合花色苷比率值大，聚合花色苷含量多，帶來了更多的黃色色調(diào)，紅色色調(diào)減少，所以a*值減小，b*值升高。游離花色苷比率與L*值的相關(guān)性不大，說明游離花色苷對葡萄酒色度的貢獻上不如處于輔色化狀態(tài)的花色苷；游離花色苷比率與b*值有顯著負相關(guān)，說明游離花色苷比例的下降會造成b*值的上升，造成葡萄酒的色調(diào)變黃，這極有可能是因為游離花色苷參與了聚合反應，生成了色調(diào)偏黃的聚合色素[33,40]，而這一過程在葡萄酒發(fā)酵和陳釀的過程中均能進行。

3 結(jié) 論

外源添加楊梅酮、山柰酚和槲皮素3 種黃酮醇輔色素后，在發(fā)酵階段，相比于對照組，添加楊梅酮的紅葡萄酒輔色花色苷比率、酚類物質(zhì)含量和a*值都更高，L*值較低，說明添加楊梅酮輔色素有利于增強紅葡萄酒中花色苷的輔色效應，促進酚類物質(zhì)的浸出，增加酒體的紅色色調(diào)和酒體色度；在陳釀階段，輔色素處理組a*值較高、L*值較低、b*值升高較慢和輔色花色苷比率更高，這都說明輔色素有利于葡萄酒陳釀期間顏色的維持和穩(wěn)定。但瓶儲12 個月后輔色花色苷比率下降到10%～15%左右，說明隨著陳釀時間的延長，花色苷和輔色素的含量逐漸下降導致輔色效應也相應減弱。綜上，在發(fā)酵前添加黃酮醇類物質(zhì)可以增強紅葡萄酒的輔色作用，使得酒體產(chǎn)生更好的顏色表現(xiàn)，特別是添加楊梅酮的葡萄酒表現(xiàn)出更優(yōu)的輔色能力。