王 黎，石 蕊，雷 媛，戴思洋

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2.陜西省人民醫(yī)院 眼科，西安 710068)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，最終可導(dǎo)致不可逆的視力喪失，是威脅人們視覺健康的首要疾病[1]。肥胖是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，脂肪的過度積累引起全身性炎癥狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼肌葡萄糖攝入量減少和肝糖異生增加[2-3]。同時(shí)，肥胖是導(dǎo)致糖尿病患者并發(fā)DR的首要危險(xiǎn)因素[4-5]，在視網(wǎng)膜微血管等組織中，肥胖引起的脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致自由基生成增加[6]。而視網(wǎng)膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUT1)不受胰島素調(diào)控，高血糖時(shí)易轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)較其他組織更多的葡萄糖。脂質(zhì)、自由基協(xié)同高糖導(dǎo)致視網(wǎng)膜中炎癥因子的積累[7-8]，其中，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的增多促使血管增殖性DR的發(fā)生[9]。

DR已被全球“視覺2020”行動(dòng)列為“可避免盲”的攻克目標(biāo)之一，但到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)可顯著遏制DR進(jìn)展的行之有效的方法。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是一種存在于魚油、橄欖油、玉米油等食用油中的多烯類脂肪酸。ω-3類PUFAs被證實(shí)對全身各系統(tǒng)具有抗炎活性，包括對視網(wǎng)膜的抗炎活性[10]。

亞麻籽油是重要的ω-3類PUFAs來源，其α-亞麻酸含量高達(dá)50%以上[11-12]。亞麻籽油還含有多酚類物質(zhì)及脂溶性維生素E，多酚類物質(zhì)能夠抗氧化、清除自由基，維生素E是重要的類脂抗氧化劑。因此，可以推測，亞麻籽油的使用有望能夠阻斷上述”脂代謝紊亂-氧化應(yīng)激壓力與高糖-炎癥-視網(wǎng)膜損傷”病理通路。然而，目前尚無亞麻籽油對DR干預(yù)作用的研究。因此，本文以視網(wǎng)膜中炎癥因子IL-10及DR的主要成因VEGF為主要指標(biāo)，研究含亞麻籽油的膳食對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠視網(wǎng)膜損傷進(jìn)展的影響，闡述含亞麻籽油的膳食對DR的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明種小鼠60只，4周齡，體重(21±4)g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠自由攝食及飲水，分籠飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)環(huán)境，室溫(22±2)℃，每日明暗時(shí)間各12 h，每周稱量動(dòng)物的體重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物準(zhǔn)則實(shí)施。

1.1.2 試劑與儀器

小鼠基礎(chǔ)飼料(顆粒型日糧維持飼料)，河南天馳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料廠；精煉豬油(食品級)，臨沂新程金鑼肉制品集團(tuán)有限公司；精煉亞麻籽油(食品級，加工工藝為壓榨，質(zhì)量等級為一級，標(biāo)稱α-亞麻酸含量52.6%)，上海嘉里食品工業(yè)有限公司；anti-IL-10與anti-VEGF抗體，圣克魯斯生物技術(shù)；γ-生育酚標(biāo)品 (純度95%)，瑞士羅氏公司；拜安進(jìn)血糖儀(國食藥監(jiān)械(進(jìn))字2014第2404310號)及拜安進(jìn)配套試紙(葡萄糖脫氫酶法，國械注(進(jìn))20142405084)；胰島素注射液(10 mL，400 U，使用前以生理鹽水稀釋)，江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司；7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫公司；YZ5X型裂隙燈顯微鏡，蘇州六六視覺科技股份有限公司；TDL-80-2B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽油中α-亞麻酸、多酚及維生素E含量測定[13-14]

測定亞麻籽油中α-亞麻酸含量時(shí)，以內(nèi)標(biāo)法定量；測定亞麻籽油中多酚含量時(shí)，以外標(biāo)法定量，多酚含量以咖啡酸含量計(jì)；測定亞麻籽油中維生素E含量時(shí)，采用外標(biāo)法定量。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)膳食的制備

小鼠的實(shí)驗(yàn)膳食均依據(jù) AIN-93G自行配制。將小鼠基礎(chǔ)飼料(粗脂肪含量4%)以粉碎機(jī)粉碎，混勻后等分為3份：1份拌入豬油，使脂肪含量達(dá)到35%，作為高脂飼料；1份采用豬油與亞麻籽油各占50%的調(diào)和油拌入油脂，同樣使脂肪含量達(dá)到35%，作為亞麻籽油飼料；1份不作調(diào)整，作為正常飼料。拌合均勻后捏制成鼠糧形狀，烘箱烘干即得實(shí)驗(yàn)膳食，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為2組，正常膳食組(SD組)及高脂膳食組(HD組)。SD組飼喂正常飼料，HD組飼喂高脂飼料，共喂養(yǎng)8周。每日稱量投喂及剩余飼料，觀察攝食情況，每周稱量小鼠體重，觀察體重變化情況。在8周結(jié)束后，測定小鼠的胰島素抵抗情況，通過體重及胰島素抵抗情況判定肥胖性糖尿病模型是否造模成功。將造模成功的小鼠隨機(jī)再分為HD組和亞麻籽油組(FOD組)，HD組繼續(xù)飼喂高脂飼料，F(xiàn)OD組飼喂亞麻籽油飼料。SD組繼續(xù)飼喂正常飼料。繼續(xù)飼喂8周后，處死全部小鼠，摘取雙眼眼球。以眼科手術(shù)器械在放大鏡下分離眼球各組織，自虹膜后切去前節(jié)部分，去除晶狀體與玻璃體，使用鑷子小心剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜并立即以液氮冷凍，于-80℃凍存。

1.2.4 小鼠的胰島素抵抗測試[15-16]

將實(shí)驗(yàn)小鼠禁食8 h，腹腔內(nèi)注射胰島素(注射劑量1.5 U/kg)，注射后在0、10、20、30 min時(shí)在尾靜脈取血，立即使用電子血糖儀測定血糖，繪制血糖隨時(shí)間的變化曲線，計(jì)算血糖相對時(shí)間的平均下降率(KITT)。

1.2.5 視網(wǎng)膜組織中VEGF、IL-10水平的ELISA法檢測[17]

將-80℃下凍存的視網(wǎng)膜組織取出，在預(yù)冷的PBS(0.01 mol/L,pH 7.0～7.2)中洗去血污，冰上加PBS研磨，反復(fù)凍融得勻漿液。用包被緩沖液(pH 9.6，0.05 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液)稀釋anti-IL-10、anti-VEGF，在96孔板上每孔加0.3 mL，4℃過夜。次日去除包被液，各孔用洗滌緩沖液(0.05% Tween20)洗滌3次。在各孔中加入稀釋液(pH 7.4,0.02 mol/L Tris緩沖液)稀釋的上述待測標(biāo)本0.2 mL，同時(shí)加入陽性和陰性對照標(biāo)本，在37℃放置90 min。去除液體后洗滌3次，加入VEGF、IL-10的酶標(biāo)抗體0.2 mL，于37℃放置90 min。去除液體后洗滌3次，加入0.2 mL底物溶液(OPD)于各孔中，室溫作用30 min，加終止劑2 mol/L H2SO4溶液0.05 mL。在酶標(biāo)儀上讀取450 nm下的吸光值，分析VEGF、IL-10水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞麻籽油中α-亞麻酸、多酚及維生素E含量

經(jīng)測定本研究所使用的亞麻籽油中α-亞麻酸平均含量為53.59%，總多酚平均含量為0.097 mg/g，其主要生育酚異構(gòu)體γ-生育酚平均含量為418.78 μg/g。

2.2 小鼠的體重變化及胰島素抵抗情況(見表1)

表1 小鼠的體重變化及胰島素抵抗情況

由表1可見： SD組及HD組小鼠在實(shí)驗(yàn)起始時(shí)，體重為(21±4) g，第8周時(shí)，SD組小鼠的體重增至(39±4) g，而HD組增至(53±5) g，HD組體重顯著大于SD組(P<0.05)；SD組小鼠的血糖相對時(shí)間的平均下降率(KITT)為3.92%/min，而HD組僅為1.94%/min，HD組小鼠血糖對胰島素注射的敏感度顯著小于SD組(P<0.05)，說明HD組已出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。結(jié)合HD組體重及胰島素抵抗情況數(shù)據(jù)，說明肥胖性糖尿病小鼠模型成功建立。

按1.2.3方法飼喂小鼠至第16周，SD組小鼠的KITT為3.25%/min, HD組僅為1.91%/min, HD組顯著小于SD組(P<0.05)，且與其第8周時(shí)的數(shù)據(jù)相比無顯著性差異(P>0.05)，說明HD組在第8周出現(xiàn)的胰島素抵抗未改善；自第8周時(shí)從HD組分出飼喂含亞麻籽油膳食的FOD組在第16周時(shí)KITT為2.98%/min，相對SD組無顯著性差異(P>0.05)，相對HD組第8周時(shí)的數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)，說明該組小鼠在第8周出現(xiàn)的胰島素抵抗已明顯改善。

第16周時(shí)，SD組小鼠的體重增至(47.5±5.0)g，HD組增至(68.3±11.0)g，F(xiàn)OD組增至(66.4±8.0)g，HD組體重顯著大于SD組(P<0.05)，但HD組與FOD組間體重?zé)o明顯差異，說明飼喂亞麻籽油在未改善小鼠肥胖的情況下，改善了其糖尿病胰島素抵抗情況。

2.3 小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、IL-10的相對表達(dá)水平(見表2)

表2 第16周時(shí)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、IL-10相對表達(dá)水平

由表2可見：HD組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF及IL-10水平均顯著高于SD組(P<0.05)；FOD組小鼠視網(wǎng)膜組織中的VEGF及IL-10水平與SD組相比無顯著性差異，相比HD組存在顯著性差異(P<0.05)。

目前的研究表明，肥胖型糖尿病患者更易發(fā)生微血管并發(fā)癥。葉守姣等[5]研究發(fā)現(xiàn)，合并肥胖的糖尿病患者的視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、周圍神經(jīng)病變、下肢血管病變顯著增多，而心腦血管病變則未增多。鄭錦標(biāo)等[4]對213例DR患者進(jìn)行患病危險(xiǎn)因素的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，肥胖對DR的影響居首，其定義比數(shù)比(odds ratio)是第二位影響因素“飲酒”的3倍多。

肥胖型糖尿病患者更易發(fā)生微血管并發(fā)癥的機(jī)制目前尚不十分清楚。目前的研究普遍認(rèn)為，可能與肥胖導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂等多種因素有關(guān)[18]，并受到脂聯(lián)素的調(diào)控[19-20]，而脂聯(lián)素受ω-3類PUFAs 的調(diào)控[21]。這有可能是亞麻籽油中富含的ω-3 類PUFAs發(fā)揮抗視網(wǎng)膜損傷作用的途徑之一。

脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激壓力可能是肥胖型糖尿病合并DR的另一原因。多酚類化合物丹酚酸A可以改善肥胖型糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜病變[22]，這可能與其對抗氧化應(yīng)激的作用有關(guān)。本研究測定了亞麻籽油中的多酚和維生素E的含量，亞麻籽油富含多酚及維生素E等抗氧化性類脂可能是其發(fā)揮抗DR作用的另一途徑。

3 結(jié) 論

在連續(xù)8周飼喂高脂飼料后，小鼠出現(xiàn)明顯的肥胖、胰島素抵抗癥狀，肥胖性糖尿病小鼠造模成功。此時(shí)，若改變飼喂方式，以混合亞麻籽油膳食飼喂肥胖性糖尿病小鼠，8周后相對高脂膳食組，其肥胖狀況未得到改善，但胰島素抵抗?fàn)顩r明顯改善，視網(wǎng)膜炎癥因子IL-10、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子VEGF水平明顯降低。因此，含亞麻籽油膳食飼喂可以改善高脂膳食引起的肥胖小鼠的視網(wǎng)膜損傷。