欒真杰，李佩佩，李 朵，皮 立，孟曉萍，孫 菁

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810008； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

馬藺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)又名馬蓮、馬蘭花，為鳶尾科鳶尾屬植物，常作為觀賞植物用于城市綠化[1]。馬藺籽，又名蠡實(shí)，收錄于《本草綱目》草部，主治寒疝諸疾、喉痹等癥。蒙藏醫(yī)理論認(rèn)為，馬藺籽主治胃痙攣、燙傷、內(nèi)外蟲疾、闌尾炎、身目發(fā)黃等癥[2-3]。自馬藺籽種皮中提取的馬藺子素及其相關(guān)制劑馬藺子素膠囊已收載于我國新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)馬藺籽種仁部分的研究則相對(duì)較少。

通過對(duì)馬藺籽的顯微特征研究發(fā)現(xiàn)，馬藺籽種仁部分含有大量油細(xì)胞[4]，其含油量在3%～12%。藥理實(shí)驗(yàn)證明馬藺籽油對(duì)小鼠無毒，主要含有亞油酸及油酸[5-6]，這些脂肪酸具有抗菌，降低血清膽固醇，預(yù)防和治療高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化癥、冠心病等作用[7-9]。但是關(guān)于馬藺籽油的提取方法、化學(xué)成分組成及生物活性方面的研究較少。因此，本研究以石油醚為提取溶劑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬藺籽油索氏法提取工藝，用GC-MS分析馬藺籽油的脂肪酸組成及不皂化物組成，并測(cè)定其體外抗氧化活性，以期為馬藺籽資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

馬藺籽，購自藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物馬藺(IrislacteaPall. var.chinensis(Fisch.) Koidz.)的干燥成熟果實(shí)，所購種子顆粒飽滿、無霉變，存放于中國科學(xué)院西北高原生物研究所。石油醚(沸程60～90℃)、氫氧化鉀、甲醇、正己烷、三氟化硼等均為分析純；標(biāo)準(zhǔn)品菜油甾醇(純度>98%)、β-谷甾醇(純度>98%)、豆甾醇(純度>95%)，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度>98%)，APExBIO公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒(A015-3 FRAP法 100T)，南京建成生物工程研究所；抗壞血酸，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 1300/8000Evo氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Epoch2微孔板分光光度計(jì)(美國伯騰儀器有限公司)，HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，YB-700多功能粉碎機(jī)，ZFJ-200中草藥粉碎機(jī)，N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，電熱鼓風(fēng)干燥箱，SHB-III循環(huán)水真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

篩除馬藺籽中的碎殼、殘葉等雜質(zhì)，然后將馬藺籽置于50℃烘箱中烘干至恒重。用多功能粉碎機(jī)碎皮后過20目篩，除去馬藺籽種皮，得到馬藺籽種仁。將種仁用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，裝于自封袋中4℃冷藏備用。

1.2.2 馬藺籽油的提取

精密稱取10.00 g馬藺籽種仁粉，以石油醚為溶劑，用索氏提取器提取一定時(shí)間，得到石油醚提取液，40℃旋蒸除盡溶劑，置于烘箱中干燥至恒重，得馬藺籽油。按下式計(jì)算馬藺籽油得率[10]。

馬藺籽油得率=馬藺籽油質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

1.2.3 馬藺籽油理化性質(zhì)分析

分別參照GB/T 22500—2008、GB/T 5532—2008、GB/T 5530—2005、GB/T 5534—2008、GB/T 5538—2005、GB/T 5535.2—2008測(cè)定紫外吸光度、碘值、酸價(jià)、皂化值、過氧化值和不皂化物含量。

1.2.4 馬藺籽油脂肪酸組成分析

1.2.4.1 馬藺籽油的甲酯化

參照GB 5009.168—2016的方法，稱取馬藺籽油0.1 g于100 mL平底燒瓶中，加入8 mL 2%氫氧化鉀-甲醇溶液，在80℃水浴上回流直至油滴消失，從回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼-甲醇溶液，繼續(xù)回流2 min，冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入10 mL正庚烷振搖2 min，再加入飽和氯化鈉溶液振搖靜置分層，吸取上層正庚烷提取液5 mL于試管中，加入3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層溶液到進(jìn)樣瓶中待GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS分析

用GC-MS對(duì)馬藺籽油脂肪酸組成進(jìn)行分析，通過檢索NIST14標(biāo)準(zhǔn)譜庫和人工解譜的方法，分析圖譜中的主要成分，并采用面積歸一化法定量。

GC-MS分析條件：安捷倫DB-FFPA毛細(xì)管色譜柱(100 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280℃；載氣為氦氣；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1；程序升溫為50℃保持1 min，以25℃/min升溫至175℃，再以4℃/min升溫至230℃，保持5 min；電離方式為電子轟擊離子源(EI)；柱頭壓力230 kPa；傳輸線溫度280℃。

1.2.5 馬藺籽油不皂化物的組成分析

分別稱取7.70 mg菜油甾醇、11.12 mg 豆甾醇和10.28 mgβ-谷甾醇于3個(gè)10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，配成甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。從上述3種標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別準(zhǔn)確移取0.4 mL于2 mL離心管中，混勻，獲得3種甾醇混標(biāo)溶液進(jìn)行GC-MS分析。以甾醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y1=1.914 42E7x+8.495 44E7(r=0.999 18)，豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y2=2.506 25E7x-1.454 65E7(r=0.999 78)，β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y3=1.474 98E7x+4.055 37E7(r=0.994 11)。

將按照GB/T 5535.2—2008制得的馬藺籽油不皂化物溶于5 mL正己烷中進(jìn)行GC-MS分析，各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖采用NIST14標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索，并逐個(gè)解析各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖，確定化合物，采用面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)含量。根據(jù)3種甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程計(jì)算馬藺籽油中菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的含量。

GC-MS分析條件：J&W DB-5MS UI毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度275℃；進(jìn)樣量 1.0 μL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；程序升溫為初始溫度180℃，以15℃/min的升溫速率升至280℃，保持25 min；EI離子源，電子能量70 ev；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；傳輸線溫度280℃；質(zhì)量范圍35～650，全掃描方式；溶劑延遲時(shí)間2 min。

1.2.6 馬藺籽油抗氧化能力測(cè)定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Ardestani等[11]的方法，分別取不同質(zhì)量濃度(0.875、1.750、3.500、7.000、14.000、28.000、56.000 mg/mL)的馬藺籽油溶液2 mL，各加入0.2 mmol/mL的DPPH-乙醇溶液2 mL，混合均勻，于常溫下避光反應(yīng)30 min，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(As)，以無水乙醇為空白對(duì)照(Ab)，以VC為陽性對(duì)照，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.2.6.2 總抗氧化能力的測(cè)定

采用FRAP法[12]測(cè)定馬藺籽油的總抗氧化能力。按照總抗氧化能力測(cè)試盒說明制備工作液，37℃水浴30 min，依次加入空白對(duì)照(水)和不同質(zhì)量濃度(7、14、28、56、112、168、224、280 mg/mL)的馬藺籽油溶液，室溫反應(yīng)6 min，測(cè)定反應(yīng)液在593 nm處的吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以FeSO4·7H2O 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別配制濃度為0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L的FeSO4溶液，按照上述方法反應(yīng)后，測(cè)定在593 nm處的吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(回歸方程為y=3.162 2x-0.365 5，r=0.997 0)。將樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得到FeSO4的濃度表示樣品的總抗氧化能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)馬藺籽油得率的影響

在料液比1∶15、提取溫度80℃的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)馬藺籽油得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)馬藺籽油得率的影響

由圖1可以看出，在1～4 h時(shí)，馬藺籽油得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，且增長(zhǎng)速度很快，而在4～6 h時(shí)，馬藺籽油得率增長(zhǎng)緩慢?？赡茉? h時(shí)馬藺籽油提取已經(jīng)基本完全，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間馬藺籽油得率趨于穩(wěn)定。因此，選擇提取時(shí)間2～6 h進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)馬藺籽油得率的影響

在料液比1∶15、提取時(shí)間4 h的條件下，考察提取溫度對(duì)馬藺籽油得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)馬藺籽油得率的影響

由圖2可以看出，當(dāng)提取溫度在65～80℃時(shí)，馬藺籽油得率隨著提取溫度的升高迅速增大，可能是溫度的升高增加了溶劑分子和油脂分子的動(dòng)能而有利于油脂分子的擴(kuò)散。當(dāng)提取溫度在80～90℃時(shí)，馬藺籽油得率有所下降，可能是因?yàn)楫?dāng)溫度接近石油醚沸程頂端時(shí)，石油醚回流速度過快，其在提取管中時(shí)間過短，難以充分提取馬藺籽油，導(dǎo)致得率下降。因此，選擇70～90℃進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 料液比對(duì)馬藺籽油得率的影響

在提取溫度80℃、提取時(shí)間4 h的條件下，考察料液比對(duì)馬藺籽油得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)馬藺籽油得率的影響

由圖3可以看出，在料液比為1∶(9～21)時(shí)，馬藺籽油得率隨料液比增加而逐漸增大，當(dāng)料液比超過1∶21時(shí)，馬藺籽油得率反而有所下降。其可能原因是當(dāng)溶劑量已經(jīng)滿足虹吸并且能充分完成提取馬藺籽油的條件時(shí)，溶劑用量過多會(huì)造成整體溶劑中低沸點(diǎn)的溶劑含量較高，回流速度過快，得率略有下降。綜合考慮，選擇料液比1∶(15～27)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、提取溫度和料液比3個(gè)影響因素，以馬藺籽油得率(Y)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理對(duì)馬藺籽油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

經(jīng)響應(yīng)面回歸分析得到馬藺籽油最佳提取工藝條件為提取時(shí)間5.917 h、提取溫度70.066℃、料液比1∶26.213，在此條件下馬藺籽油得率的理論值達(dá)到11.23%?？紤]到實(shí)際操作，將最佳工藝條件修正為提取時(shí)間6 h、提取溫度70℃、料液比1∶26。在最佳工藝條件下進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，馬藺籽油得率平均值為11.20%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.27%，說明響應(yīng)面法得到的提取條件是可行的。

2.3 馬藺籽油的理化性質(zhì)

用紫外全波長(zhǎng)掃描的方法確定馬藺籽油的最大吸收波長(zhǎng)為265 nm，在此波長(zhǎng)下配制質(zhì)量濃度為0.124 1 g/100 mL的馬藺籽油溶液，測(cè)得紫外吸光度為4.667。馬藺籽油呈黃色透明狀。經(jīng)測(cè)定，馬藺籽油不皂化物含量1.37%，皂化值(KOH)185.2 mg/g，酸價(jià)(KOH)0.038 mg/g，碘值(I)113.7 g/100 g，過氧化值5.159 mmol/kg。油脂的碘值較高，表明其不飽和程度較高，容易氧化。

2.4 馬藺籽油的脂肪酸組成

馬藺籽油主要脂肪酸組成及相對(duì)含量見表4。由表4可知，馬藺籽油主要含有19種脂肪酸，其中飽和脂肪酸主要為棕櫚酸(6.88%)及硬脂酸(2.38%)，不飽和脂肪酸主要為亞油酸(45.32%)和油酸(38.42%)，不飽和脂肪酸含量為84.71%。亞油酸是功能性多不飽和脂肪酸中被最早認(rèn)識(shí)的一種，是必需脂肪酸，具有降低血清膽固醇水平作用，我國2015版藥典將亞油酸乙酯丸劑、滴劑作為預(yù)防和治療高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化癥、冠心病的藥物[8]。此外，亞油酸還是ω-6長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，尤其是γ-亞麻酸和花生四烯酸的前體[9]。

表4 馬藺籽油主要脂肪酸組成及相對(duì)含量 %

2.5 馬藺籽油不皂化物的組成

馬藺籽油不皂化物的組成及相對(duì)含量見表5。

由表5可見，對(duì)馬藺籽油不皂化物共鑒定出36種成分，其中甾醇類化合物9種，分別為β-谷甾醇(19.51%)、豆甾醇(11.80%)、豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇(11.64%)、菜油甾醇(9.04%)、α1-谷甾醇(4.98%)、9,19-環(huán)羊毛甾-24-烯-3β-醇(3.71%)、24-亞甲基-9,19-環(huán)羊毛甾烯-3β-醇(3.02%)、蒲公英甾醇(1.90%)、γ-扶桑甾醇氧化物(0.59%)，總含量高達(dá)66.19%。含量在5%以上的甾醇有β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇和菜油甾醇。β-谷甾醇具有包括抗炎、抗癌和免疫調(diào)節(jié)特性在內(nèi)的多種藥理活性[13]，豆甾醇及菜油甾醇與低膽固醇油聯(lián)用可以預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的增重、肝損傷和高脂血癥[14]。為此，采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)馬藺籽油中這3種甾醇含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明β-谷甾醇含量為725.87 mg/kg，豆甾醇含量為1 231.55 mg/kg，菜油甾醇含量為410.50 mg/kg。其中豆甾醇含量比其他13種常見的植物油(米糠油1 060.44 mg/kg，大豆油248.42 mg/kg、玉米油238.71 mg/kg、芝麻油226.40 mg/kg、花生油181.58 mg/kg、棕櫚仁油134.46 mg/kg、葵花籽油114.93 mg/kg、茶籽油78.70 mg/kg、椰子油78.37 mg/kg、小麥胚芽油75.62 mg/kg、棕櫚油55.23 mg/kg、菜籽油30.21 mg/kg、橄欖油11.66 mg/kg)[15]含量高。馬藺籽油不皂化物中的豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇，因其側(cè)鏈中亞乙基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，在煎炸油中起著抗氧化劑和抗聚合劑的作用，在煎炸過程中對(duì)其他抗氧化劑也具有協(xié)同作用。高含量的豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇可以保證食品加工過程中更高的熱穩(wěn)定性[16]。

表5 馬藺籽油不皂化物的組成及相對(duì)含量 %

2.6 馬藺籽油的抗氧化能力

2.6.1 馬藺籽油DPPH自由基清除能力(見圖4)

圖4 馬藺籽油對(duì)DPPH自由基的清除能力

由圖4可知，陽性對(duì)照VC的DPPH自由基清除率最高可達(dá)84.94%，說明該方法可行有效。馬藺籽油的DPPH自由基清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。在馬藺籽油質(zhì)量濃度為28.000 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)61.15%。經(jīng)計(jì)算，馬藺籽油DPPH自由基清除率的IC50(DPPH自由基清除率達(dá)50%時(shí)馬藺籽油的質(zhì)量濃度)為19.860 mg/mL。

2.6.2 馬藺籽油的總抗氧化能力(見圖5)

FRAP法反映了被測(cè)物對(duì)Fe3+的還原能力[12]。由圖5可知，不同質(zhì)量濃度的馬藺籽油對(duì)Fe3+均具有一定的還原能力，且隨著質(zhì)量濃度的升高，還原能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)馬藺籽油質(zhì)量濃度為280 mg/mL 時(shí)，總抗氧化能力達(dá)0.202 4 mmol/L。

圖5 不同質(zhì)量濃度馬藺籽油的總抗氧化能力

3 結(jié) 論

以石油醚為提取溶劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化馬藺籽油的提取工藝條件，得到最佳工藝條件為提取時(shí)間6 h、提取溫度70℃、料液比1∶26，在此條件下馬藺籽油得率為11.20%。馬藺籽油在265 nm處的吸光度為4.667，呈現(xiàn)黃色透明狀，皂化值(KOH)185.2 mg/g，酸價(jià)(KOH)0.038 mg/g，碘值(I)113.7 g/100 g，過氧化值5.159 mmol/kg。馬藺籽油不飽和脂肪酸含量為84.71%，主要為亞油酸(45.32%)及油酸(38.42%)；不皂化物中甾醇類化合物總含量高達(dá)66.19%，主要為β-谷甾醇(19.51%)、豆甾醇(11.80%)、豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇(11.64%)和菜油甾醇(9.04%)。馬藺籽油DPPH自由基清除率的IC50值為19.860 mg/mL，F(xiàn)RAP法測(cè)定其在質(zhì)量濃度280 mg/mL時(shí)總抗氧化能力為0.202 4 mmol/L。