向光明，劉秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，馬 琳，曾憲垠，曹曉涵*，儲(chǔ)明星*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014)

中國(guó)是傳統(tǒng)的養(yǎng)羊大國(guó)，但大部分綿羊?qū)儆诩竟?jié)性繁殖品種，嚴(yán)重限制了綿羊的生產(chǎn)效率[1]，因此從分子角度尋找與綿羊繁殖相關(guān)的基因具有重要的意義。

PER3基因在1988年由兩個(gè)獨(dú)立的團(tuán)隊(duì)克隆并發(fā)表[2-3]，其蛋白序列與PER1、PER2差異較大，綿羊的編碼區(qū)序列與人、小鼠和牛的相似度只有60%左右[4]。PER1、PER2是生物鐘的核心成分，對(duì)生物鐘的調(diào)控起著重要作用，然而PER3基因是否對(duì)生物鐘起著重要調(diào)控作用還不明確。已有研究發(fā)現(xiàn)PER3蛋白是生物鐘基因轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的成分之一，PER3作為生物鐘基因的核心組分，有可能是一種鐘控基因[5-6]。目前，關(guān)于PER3的研究主要集中在睡眠、疾病等方面，很多研究發(fā)現(xiàn)PER3基因的第18外顯子中存在54個(gè)堿基的4或5次的非直接重復(fù)序列，即串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(VNTR),該突變與人的睡眠以及大腦活動(dòng)有關(guān)[7-9]；Zhu等[10]和郭煜升等[11]也發(fā)現(xiàn)PER3的多態(tài)性與乳腺癌、肝細(xì)胞癌有關(guān)。近年來(lái)很多研究表明，生物鐘對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖有著重要調(diào)控作用，鐘基因不僅在繁殖相關(guān)的重要組織中節(jié)律表達(dá)，且異常表達(dá)的鐘基因可能導(dǎo)致繁殖能力下降，甚至不育[12-14]。Nakao等[15]在日本鵪鶉中發(fā)現(xiàn)PER3基因與優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育有關(guān)；Delaunay等[16]在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)PER3基因在胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用；Lin等[17]在大鼠中發(fā)現(xiàn)高脂的生活習(xí)慣能影響卵泡的發(fā)育，同時(shí)能夠影響PER3基因的表達(dá)水平，但鐘基因PER3是否對(duì)綿羊季節(jié)性繁殖具有調(diào)控作用還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)一方面探究PER3基因?qū)竟?jié)性發(fā)情的影響，另一方面研究PER3多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)，綜合分析PER3基因?qū)d羊季節(jié)性繁殖的影響，為肉羊繁殖的分子遺傳機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和主要試劑

蘇尼特羊和小尾寒羊均來(lái)自天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)基地。選取健康的非發(fā)情蘇尼特羊母羊(長(zhǎng)光照)和小尾寒羊母羊(黃體期)各3只，在同期發(fā)情后第7天進(jìn)行屠宰，然后分別采集下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、子宮體、輸卵管、腎和腎上腺10種組織，迅速將采集的新鮮組織裝入2 mL的RNase-Free凍存管中，并立即置于液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室后全部轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織總RNA的提取和cDNA的合成

采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根)加Trizol(Invitrogen)提取各組織總RNA[18]，并用Nanodrop 2000檢測(cè)提取RNA的濃度和OD值，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。質(zhì)檢合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，具體的反應(yīng)程序和體系參照試劑盒說(shuō)明書。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的綿羊PER3基因mRNA的預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)為XM_012187372.1)，利用Primer 3.0在線軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin(NM_001009784)作為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

表1 綿羊PER3基因的引物信息Table 1 Primer information of PER3 gene in sheep

1.4 qPCR 反應(yīng)

1.4.1 qPCR反應(yīng)體系和程序 反應(yīng)體系(20 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 s，63 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將cDNA樣本5倍稀釋后，再進(jìn)行2倍梯度稀釋獲得5個(gè)濃度梯度的cDNA樣品，以5倍稀釋的cDNA樣本濃度為1，則這5個(gè)cDNA樣品的濃度梯度分別為1、1/2、1/4、1/8和1/16。用這些cDNA作為模板對(duì)目的基因和內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，以濃度梯度的對(duì)數(shù)值(10為底數(shù))為橫坐標(biāo)，以檢測(cè)所得Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 分型樣品

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量[18-20]，用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型中單因素方差分析的 Duncan法，對(duì)不同發(fā)情性狀之間PER3基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，并對(duì)該基因的不同SNPs與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)做關(guān)聯(lián)分析。用Excel 2016計(jì)算PER3基因不同SNPs的的不同基因型在季節(jié)發(fā)情和常年發(fā)情之間的差異，同時(shí)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析(包括基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量等)，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取和cDNA合成

用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。如圖1所示，RNA完整性良好，同時(shí)以β-actin為內(nèi)參，PER3為目的基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到單一且銳利的熔解曲線，說(shuō)明引物特異性好，可以進(jìn)行后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

2.2 PER3基因在不同綿羊組織的表達(dá)

qPCR結(jié)果表明，PER3基因在季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊和常年發(fā)情的小尾寒羊繁殖相關(guān)各組織中均有表達(dá)；蘇尼特羊的PER3基因表達(dá)量在松果體中顯著高于小尾寒羊(P<0.05)，子宮中差異極顯著(P<0.01)，其它組織中兩個(gè)品種之間的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，但除了輸卵管外，PER3基因在其它組織(下丘腦、垂體、卵巢)的表達(dá)量均略高于小尾寒羊(圖2)。

2.3 PER3基因的多態(tài)性分析

對(duì)PER3基因13個(gè)SNPs進(jìn)行分型，結(jié)果表明，PER3基因g.43657503A>G、g.43669480T>C、g.43669727T>C、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C、g.43677274T>C和g.43707227G>A等8個(gè)SNPs在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊有3種基因型，g.43669493T>C、g.43670763C>T、g.43670925C>T、g.43677962A>G和g.43701901A>G 5個(gè)SNPs在兩種不同發(fā)情品種的綿羊中只有2種基因型(圖3)。

為了研究PER3基因13個(gè)SNPs在季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情綿羊品種之間分布的差異，在兩種不同發(fā)情性狀的綿羊中分別對(duì)不同SNPs的基因型和等位基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表3所示。其中g(shù).43657503A>G、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C和g.43707227G>A 5個(gè)SNPs在季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率、等位基因頻率均達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

對(duì)5個(gè)在2種不同發(fā)情性狀綿羊頻率分布具有顯著差異的SNPs在6個(gè)綿羊品種中進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，如表3所示。

表2 PER3基因不同SNPs在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊中基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequencies of different SNPs at PER3 gene in seasonal and year-round estrous sheep

表3 PER3基因不同SNPs在6個(gè)不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析Table 3 Population genetic analysis of different SNPs at PER3 gene in 6 sheep breeds

2.4 PER3基因與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在380只具有產(chǎn)羔數(shù)記錄的小尾寒羊中，共檢測(cè)到12個(gè)SNPs(如表4)。其中g(shù).43657503A>G、g.43669493T>C、g.43669727T>C、 g.43670925C>T、g.43677962A>G、g.43701 901A>G 6個(gè)位點(diǎn)只有兩種基因型，它們的野生型數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于突變型，雖然兩種基因型之間的產(chǎn)羔數(shù)并無(wú)顯著差異(P>0.05)，但這種少量的雜合突變導(dǎo)致產(chǎn)羔數(shù)降低。其它6個(gè)位點(diǎn)有3種基因型，其中g(shù).43669480T>C、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43707227G>A 4個(gè)位點(diǎn)的突變型數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型，雖然4個(gè)位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)，但這種突變往往導(dǎo)致產(chǎn)羔數(shù)增加，純合突變更加明顯。g.43677259T>C和g.43677274T>C位點(diǎn)的突變型也較多，但純合突變少，且有趣的是這種突變卻導(dǎo)致產(chǎn)羔數(shù)減少，純合的減少更多。

表4 PER3基因不同位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤Table 4 Least squares means and standard errors of litter size of different genotypes of SNPs at PER3 gene in Small-tail Han sheep

3 討 論

3.1 PER3基因在綿羊繁殖相關(guān)組織之間的表達(dá)分析

本研究發(fā)現(xiàn)PER3基因在季節(jié)發(fā)情的蘇尼特羊和常年發(fā)情的小尾寒羊繁殖相關(guān)的組織中均有表達(dá)，這與核心鐘基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)各組織表達(dá)相一致[21-22];另在兩種綿羊中，PER3基因在下丘腦和子宮中的均表達(dá)高于其它組織，說(shuō)明有一定的組織特異性，這與之前Pendergast等[23]的研究結(jié)果一致。

哺乳動(dòng)物季節(jié)性發(fā)情的主要生理過(guò)程是光照→下丘腦→松果體→下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)，其中松果體分泌的褪黑激素是季節(jié)性繁殖動(dòng)物生殖行為隨光周期變化的中心信號(hào)分子[24]，下丘腦、垂體是季節(jié)性發(fā)情調(diào)控的控制中心[25-26]，在季節(jié)性發(fā)情蘇尼特羊和常年發(fā)情小尾寒羊中對(duì)PER3基因表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)松果體中PER3基因的表達(dá)量在蘇尼特羊中顯著高于小尾寒羊，下丘腦、垂體中PER3基因的表達(dá)量也高于小尾寒羊，說(shuō)明PER3基因很可能對(duì)季節(jié)性發(fā)情起著重要調(diào)控作用，且有可能是在發(fā)情信號(hào)通路的上游發(fā)揮作用，Delaunay等[16]發(fā)現(xiàn)PER3基因在斑馬魚胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜中紀(jì)律性表達(dá)也反映了這一點(diǎn)。另外兩種綿羊都處于非發(fā)情期，光照刺激通過(guò)增強(qiáng)雌激素的負(fù)反饋?zhàn)饔枚种菩韵佥S的活性[24]，GnRH/LH周期性釋放活動(dòng)停止，導(dǎo)致PER3基因在兩種羊的下丘腦、垂體和卵巢的表達(dá)量都降低。在卵巢和子宮中，蘇尼特羊PER3基因的表達(dá)量都高于小尾寒羊。卵巢是卵泡發(fā)育的場(chǎng)所，說(shuō)明PER3基因較高表達(dá)可能與卵泡的發(fā)育調(diào)控有關(guān)。Nakao等[15]在家禽中發(fā)現(xiàn),在排卵前的大卵泡中有PER3基因的節(jié)律表達(dá),而在小卵泡中沒(méi)有也說(shuō)明了這一點(diǎn)。研究表明哺乳動(dòng)物發(fā)情、排卵等行為又受生物鐘的調(diào)控[27]，所以PER3基因可能作為鐘控基因調(diào)節(jié)PER1、PER2基因的表達(dá)，進(jìn)而影響兩種綿羊卵巢中不同激素的表達(dá)情況來(lái)調(diào)控綿羊的發(fā)情性狀。子宮中蘇尼特羊PER3基因的表達(dá)量顯著高于小尾寒羊，可能與該時(shí)期子宮狀態(tài)有關(guān)。子宮對(duì)著床的敏感度分為3個(gè)時(shí)期，即預(yù)受期、接受期及不應(yīng)期，而子宮只有在接受期才能接受和適應(yīng)胚胎。本試驗(yàn)的小尾寒羊剛進(jìn)入黃體期，子宮可能處于不應(yīng)期，PER3的表達(dá)量較低。另外還有很多研究表明輸卵管和子宮中的鐘基因PER3的表達(dá)可能與受精和胚胎的發(fā)育有關(guān)[16,28-29]。

3.2 PER3基因多態(tài)性與綿羊季節(jié)性發(fā)情的關(guān)系

通過(guò)重測(cè)序在6個(gè)綿羊品種中發(fā)現(xiàn)了PER3基因的13個(gè)SNPs，其中g(shù).43657503A>G、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C和g.43707227G>A 5個(gè)SNPs在季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率、等位基因頻率均達(dá)到顯著差異，表明其可能是與綿羊的季節(jié)性發(fā)情重要的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。對(duì)這5個(gè)SNPs的群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，僅g.43657503A>G和g.43677259T>C 2個(gè)位點(diǎn)在小尾寒羊和蘇尼特羊中均表現(xiàn)為中度多態(tài)性，說(shuō)明這兩個(gè)位點(diǎn)在小尾寒羊和蘇尼特羊具有較強(qiáng)的選擇潛力。其它位點(diǎn)在不同綿羊品種中多態(tài)性不一致，表明不同的SNPs在不同綿羊品種中的選擇潛力不同，這與之前的研究相一致[30]。而且這5個(gè)SNPs在6個(gè)綿羊品種中均處于哈代溫伯格平衡,表明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化和選擇，這些位點(diǎn)在適應(yīng)性方面具有一定的遺傳優(yōu)勢(shì)。

3.3 PER3基因與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

通過(guò)上述突變位點(diǎn)與小尾寒羊1～3胎產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析可知，雖然這些突變位點(diǎn)與各胎產(chǎn)羔數(shù)并不顯著關(guān)聯(lián)，但PER3基因位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬线€會(huì)影響小尾寒羊各胎產(chǎn)羔數(shù)。通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)少量個(gè)體的雜合突變位點(diǎn)(如g.43657503A>G、g.43669493T>C等)基本都會(huì)導(dǎo)致1～3胎的產(chǎn)羔數(shù)降低，而從進(jìn)化角度來(lái)說(shuō)，群體產(chǎn)羔數(shù)減少意味著群體數(shù)量減少，不利于群體進(jìn)化，這就說(shuō)明這些突變對(duì)綿羊群體來(lái)說(shuō)是一種有害突變。而大量的突變甚至有大量的純合突變(如g.43669480T>C、g.43670012T>C、g.43670807A>G等)會(huì)導(dǎo)致小尾寒羊1～3胎的產(chǎn)羔數(shù)提高，而且往往純合突變升高的更明顯，說(shuō)明這些突變位點(diǎn)對(duì)綿羊群體是一種有益突變。當(dāng)然這些位點(diǎn)與小尾寒羊各胎的產(chǎn)羔數(shù)均不顯著關(guān)聯(lián)的原因可能是小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)受多個(gè)基因共同影響的表型，而目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FecB基因是影響小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因[31]，其它基因的單個(gè)SNP并不能顯著影響小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)，而對(duì)其它綿羊品種是否有影響需要進(jìn)一步研究，但這也表明PER3基因的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)很重要。在具有產(chǎn)羔記錄的380只中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)g.43670763C>T位點(diǎn)突變，一種可能是小尾寒羊并沒(méi)有該位點(diǎn)突變，也可能是選擇樣品的數(shù)量還是不夠大。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)在季節(jié)性發(fā)情的蘇尼特羊中，PER3基因在松果體、下丘腦和垂體等繁殖相關(guān)組織的表達(dá)量均高于常年發(fā)情小尾寒羊，推測(cè)PER3基因很可能與綿羊季節(jié)性發(fā)情調(diào)控有關(guān)，且該基因的g.43657503A>G、g.43670012T>C、g.43670807A>G、g.43677259T>C和g.43707227G>A 5個(gè)SNPs可能是與綿羊季節(jié)性發(fā)情相關(guān)的關(guān)鍵位點(diǎn)；PER3的SNPs與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)性狀并不顯著關(guān)聯(lián)，但在一定程度上能影響其產(chǎn)羔數(shù)。