李建濤 劉向榮 楊 杰 莊肅凱

(1.商洛學院化學工程與現(xiàn)代材料學院，726000 陜西商洛；2.陜西省尾礦綜合利用重點實驗室，726000 陜西商洛；3.西安科技大學化學與化工學院，710054 西安)

0 引 言

褐煤在空氣中容易風化，燃燒時對空氣污染嚴重，但隨著優(yōu)質煤逐漸被采空，褐煤已成為我國主要使用的煤種之一。因此，減少褐煤利用過程中產生的環(huán)境污染，實現(xiàn)褐煤的高效清潔利用刻不容緩[1-3]。褐煤轉化利用的途徑主要有：氣化、液化、熱解和微生物降解等。其中，褐煤的氣化、液化和熱解技術成熟，但由于這幾種轉化技術需要高溫、高壓等苛刻條件，存在能耗高、對設備要求高等不足，人們渴望尋求一種工藝條件溫和、能耗低、對設備要求簡單的褐煤轉化利用技術[4-5]。20世紀80年代， FAKOUSSA[6]和COHEN et al[7]相繼報道了假單胞菌和白腐菌能夠降解煤，這一實驗事實引起了各國研究者的極大興趣，煤的微生物降解作為煤清潔高效利用的新技術成為研究熱點。細菌是煤降解過程中的主要作用菌之一，研究優(yōu)化其降解煤的工藝條件至關重要。

響應曲面法(RSM)通過數學統(tǒng)計方法設計實驗、建立模型、評估實驗因素效果并尋求最優(yōu)化工藝參數，是一種優(yōu)化反應條件和加工工藝參數的有效方法[8]。該方法實驗設計合理，能以較少的實驗數量和更經濟的方式對實驗進行全面研究，可以快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，廣泛地應用于各類條件優(yōu)化實踐中，并取得了滿意的結果[9]。但響應曲面法優(yōu)化煤的微生物降解工藝方面的報道較為鮮見。占迪等[10]采用Box-Behnken設計，通過響應曲面法優(yōu)化，得出了混合微生物菌群轉化褐煤產甲烷的最佳工藝及各條件對甲烷產量影響的顯著性。賈建軍等[11]通過曲面響應法對熱帶假絲酵母溶煤的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化研究，得出了培養(yǎng)基的最佳配方。王靜[12]采用響應曲面法對多黏類芽孢桿菌降解硝酸氧化寶雞長焰煤的工藝條件進行了優(yōu)化?？梢姡憫娣ㄊ俏⑸锝到饷汗に噮岛团囵B(yǎng)基組成等方面行之有效的優(yōu)化方法。

煤的氧化預處理有利于微生物對煤的降解，常用的方法有硝酸氧化法、雙氧水氧化法、臭氧氧化法、高溫空氣氧化法和光-氧氧化法等[13-14]。其中光-氧氧化法由于對煤原有結構破壞程度小、氧化效率高、可操作性強、污染小等優(yōu)點，近年來有了長足的發(fā)展[15-16]。

前期菌-煤匹配實驗篩選出降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的細菌優(yōu)勢菌株為惡臭假單胞菌，單因素實驗確定的較優(yōu)工藝條件為：加煤量0.3 g/20 mL，接種量2.0 mL/20 mL，降解時間12 d，培養(yǎng)箱振蕩頻率160 r/min，煤樣粒度0.150 mm～0.075 mm，降解溫度30 ℃。在此基礎上，利用響應曲面法對優(yōu)勢菌株惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的降解工藝進行建模和優(yōu)化研究，旨在得出可靠的預測模型和最佳降解工藝條件，為褐煤的微生物高效轉化利用提供一定的技術參考。

1 實驗部分

1.1 煤樣

實驗所用煤樣為內蒙勝利褐煤(SLH)。煤樣在60 ℃條件下，烘干3 h，經破碎、粉磨、篩分得到粒度為0.150 mm～0.075 mm的煤樣。然后，利用自行設計加工的旋轉床光化學反應器[17]對煤樣進行光-氧氧化預處理，預處理條件為：加煤量20 g，煤樣粒度0.150 mm～0.075 mm，紫外光強度150 W，馬達轉速120 r/min，氧化時間42 h，通氧時間40 min[18]得到光-氧氧化內蒙勝利褐煤(GSLH)。褐煤及光-氧氧化褐煤的工業(yè)分析和元素分析結果見表1。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of samples

1.2 菌株及復壯

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基

本實驗所用細菌菌株為前期菌-煤匹配實驗篩選的優(yōu)勢菌株惡臭假單胞菌(pseudomonasputida，PSP)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4～7.6，固體培養(yǎng)基加15 g瓊脂。

1.2.2 菌株的活化及復壯

將斜面保藏的惡臭假單胞菌(PSP)接種至裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，在溫度為30 ℃，振蕩頻率為160 r/min的條件下，培養(yǎng)2 d。然后在預先倒好的LB培養(yǎng)基平板上劃線，倒置于人工氣候培養(yǎng)箱，在溫度為30 ℃，相對濕度為80%條件下，培養(yǎng)2 d，觀察無雜菌后，用接種針挑少量菌體放入裝有50 mL無菌水和玻璃珠的錐形瓶中充分振蕩，用接種環(huán)蘸取一孔接種于裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，將試管放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，在30 ℃、振蕩頻率為160 r/min條件下，培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)蘸取一孔接種至裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，相同條件培養(yǎng)2 d，所得惡臭假單胞菌菌液作為實驗母菌液。

1.3 降解實驗

取試管若干，每個試管中裝LB液體培養(yǎng)基20 mL，做惡臭假單胞菌(PSP)對光-氧氧化內蒙勝利褐煤(GSLH)的降解實驗，設置三組平行實驗。每只試管分別用移液槍量取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL復壯好的惡臭假單胞菌(PSP)母菌液接種，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度為30 ℃，振蕩頻率為160 r/min，培養(yǎng)2 d，接種的培養(yǎng)基變渾濁。分別加入0.20 g，0.30 g，0.40 g粒度為0.150 mm～0.075 mm經預處理的煤樣，放入恒溫培養(yǎng)箱，分別繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 d，12 d和18 d后，三組平行實驗的降解產物分別離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過濾，濾液再過0.22 μm微孔濾膜，以去離子水為參比，在分光光度計上檢測濾液在450 nm處的吸光度，求得三組平行實驗的A450平均值，以此作為指標評價惡臭假單胞菌對光-氧氧化內蒙勝利褐煤的降解效果[19-20]。

1.4 響應面實驗設計

在前期單因素實驗結果的基礎上，對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤(GSLH)效果影響較大的工藝條件(加煤量、接種量和降解時間，分別記為A，B和C)進行響應面優(yōu)化研究，其他條件選取單因素實驗確定的較優(yōu)值。利用Box-Behnken設計法進行實驗設計，以A，B和C為自變量，降解液在450 nm處的吸光度A450為響應值，表示為Y(A450)，進行響應面優(yōu)化研究，最終得出最佳工藝條件及響應值Y(A450)與工藝條件取值之間的關系模型方程。實驗方案設計見表2。

表2 Box-Behnken響應面設計Table 2 Response surface design by Box-Behnken method

2 結果與討論

2.1 實驗結果及建模

利用Design Expert 8.0軟件，選擇Box-Behnken設計法進行參數設置，按照生成的實驗方案進行實驗，得到對應的降解液吸光度A450值。實驗方案及結果見表3。

根據表3數據，利用軟件進行二次多元回歸擬合，對所得模型進行顯著性檢驗，得出降解液吸光度響應值Y(A450)對加煤量(A)，接種量(B)，降解時間(C)的二次多項式回歸方程見公式(1)和公式(2)，其中公式(1)中的自變量為實際值，公式(2)中的自變量為代碼值。

Y(A450)=-14.862 88+69.894 25A+5.127 45B+0.711 85C-3.022 50AB-0.083 333AC+0.050 042BC-117.255 00A2-0.936 80B2-0.028 474C2

(1)

Y(A450)=5.59-0.75A+1.07B+0.62C-0.30AB-0.050AC+0.30BC-1.17A2-0.94B2-0.1.03C2

(2)

表3 Box-Behnken設計實驗及結果Table 3 Designed experiments and its results by Box-Behnken method

2.2 模型的可信度分析

對2.1節(jié)中擬合所得的惡臭假單胞菌降解光-氧氧化勝利褐煤(GSLH)過程的模型進行顯著性檢驗，回歸模型的系數顯著性檢驗見表4(其中，df為自由度；F為統(tǒng)計量檢驗值；P為顯著性檢驗值；**表示影響非常顯著(P<0.01))。

表4 響應曲面模型的二次回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表4還可知，在二次模型中，一次項A，B和C對響應值Y(A450)的影響均非常顯著(P<0.01)；二次項A2，B2和C2對指標Y(A450)的影響都非常顯著(P<0.01)；交互項中，AB對響應值Y(A450)的影響較顯著(P<0.01)，AC對指標Y(A450)的影響不顯著(P>0.05)，BC對指標Y(A450)的影響非常顯著(P<0.01)。

圖1所示為標準曲線殘差概率與學生化殘差概率的擬合曲線。由圖1可以看出，實驗點分布均勻，標準曲線具有較好的擬合性，殘差基本滿足正態(tài)分布，可用該回歸方程對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的降解效果進行預測分析。

圖1 殘差的正態(tài)概率分布擬合曲線Fig.1 Fitting curve of normal probability distribution of residuals

2.3 工藝條件的響應面分析及優(yōu)化

惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤工藝條件的響應面函數模型和等高線見圖2～圖4。由此可更直觀地說明，加煤量、接種量和降解時間對降解液吸光度A450值的影響及因素間交互作用的強弱。其中，等高線形狀可以判斷降解過程中加煤量、接種量和降解時間兩兩之間的交互作用強弱，且在同一條等高線上所有降解方案都得到相同的降解液吸光度A450值。其坡度趨勢越陡則代表變化的趨勢越明顯，對實驗指標影響則越大，而且通過得到的響應曲面可以很直觀地看出指標受各條件因素影響的程度大小[23-25]。

圖2所示為降解時間為12 d時，加煤量與接種量對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的等高線和響應曲面。由圖2可知，當接種量接近1.0 mL/20 mL時，隨著加煤量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐漸增大后逐漸減小。當接種量接近3.0 mL/20 mL時，隨著加煤量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐增大后快速減?。划敿用毫拷咏?.20 g/20 mL，隨著接種量的增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度緩慢增大，最后趨于平緩。由此可知，加煤量和菌株接種量之間存在一定的相互影響，當加煤量較小時，接種量增大到一定值后再持續(xù)增大，菌株對于煤的降解作用并不會增大。這是由于，當加煤量較小時，當細菌分泌的降解煤活性物質(堿、酶、螯合劑和表面活性劑等)與煤結構中對應的活性點反應以后還有過剩；當加煤量過大時，煤漿濃度過大會對細菌產生抑制作用，導致細菌生長繁衍受阻，導致分泌的降解煤活性物質量減少，從而降解效果變差，所以加煤量和菌株接種量要有一個合理配比，才能達到最佳降解效果。再根據F=79.11，P<0.000 1，可知加煤量與接種量的交互作用對降解液吸光度的影響顯著[21]。

圖2 加煤量和接種量對降解液吸光度的等高線和響應曲面Fig.2 Effect of coal amount and inoculum size on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

圖3所示為接種量為2.0 mL/20 mL時，加煤量與降解時間對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的等高線和響應曲面。由圖3可知，當降解時間接近6 d時，隨著加煤量增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先緩慢增大后徐徐減小，趨勢平緩；當加煤量接近0.20 g/20 mL時，隨著降解時間延長，菌株降解煤所得降解液的吸光度緩慢增大，最后趨于平緩。由此可知，加煤量和降解時間之間存在一定的相互影響，但曲面變化趨勢較平緩，且當降解時間延長至一定值后再持續(xù)增大，菌株對于煤的降解效果并無明顯變化。再根據F=2.16，P=0.184 7>0.05可知，加煤量與降解時間二因素間的交互作用對降解液吸光度的影響不顯著。

圖3 加煤量和降解時間對降解液吸光度的等高線和響應曲面Fig.3 Effect of coal amount and degradation time on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

圖4所示為加煤量為0.3 g/20 mL時，降解時間與接種量對惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤降解液吸光度的等高線和響應曲面。由圖4可知，當接種量接近1.0 mL/20mL時，隨著降解時間延長，菌株降解煤所得降解液的吸光度先逐漸增大后逐漸減??；當降解時間接近6 d時，隨著接種量增大，菌株降解煤所得降解液的吸光度先緩慢增大，最后稍有降低。結合等高線可知，當降解時間在12 d到15 d之間，菌株接種量在2.5 mL/20 mL至3.0 mL/20 mL之間時，菌株降解煤所得的降解液吸光度可以達到較佳值。根據F=78.07，P<0.000 1可知，降解時間與接種量的交互作用對降解液吸光度的影響顯著。

圖4 接種量和降解時間對降解液吸光度的等高線和響應曲面Fig.4 Effect of inoculum size and degradation time on contour and response surface of absorbance of degradation liquid

按照實際因素多元二次方程回歸擬合所得的模型方程，根據快速上升法，軟件給出惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的最佳工藝條件為：加煤量0.26 g/20 mL、 接種量2.71 mL/20 mL、降解時間14.50 d，對應降解液的吸光度A450值為6.256 87。

按照最佳工藝條件，進行三組平行驗證實驗，實際測得降解液的吸光度A450的平均值為5.936，與模型預測值偏差5.12%，偏差較小。因此，可認為利用響應曲面分析法得到的惡臭假單胞菌降解光-氧氧化勝利褐煤的模型可信度高，得到的降解工藝條件具有一定的實際應用價值。

按照此最佳工藝條件進行惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的實驗，降解率為40.98%，降解液體產物的正己烷萃取物中含有34種化合物，主要為酯、雜環(huán)化合物、酰胺、烷烴和烯烴，可進一步研究從降解液中分離提取烴類燃料油和其他化學品。

3 結 論

1) 利用Design-Expert 8.0軟件，通過Box-Behnken設計建立響應曲面模型，經分析發(fā)現(xiàn)二次模型的失擬項不顯著，復相關系系數為0.999 0，模型擬合度好、可靠性高。在二次模型三個因素中，一次項和平方項均對響應值影響顯著；交互作用中，加煤量和接種量、接種量和降解時間之間的交互作用顯著，而加煤量和降解時間之間的交互作用不顯著。

2) 響應曲面優(yōu)化得出的惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的最佳條件為：加煤量為0.26 g/20 mL、接種量為2.71 mL/20 mL、降解時間為14.50 d，對應降解液的吸光度A450值為6.256 87。驗證實驗實際測得降解液的吸光度A450值為5.936，模型預測值偏差5.12%，與理論值較為一致，可見該模型較好模擬了各變量因素和響應值之間的關系。

3) 按照此最佳工藝條件進行惡臭假單胞菌降解光-氧氧化內蒙勝利褐煤的實驗，降解率為40.98%，降解液體產物的正己烷萃取物中含有34種化合物，主要為酯、雜環(huán)化合物、酰胺、烷烴和烯烴，可進一步研究從降解液中分離提取烴類燃料油和其他化學品。