夏 蘊(yùn) 巢建國* 谷 巍 盛業(yè)龍 王玉卓 惠西珂 王 凱 王圓圓

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)， 江蘇南京210023； 2.常州市孟河雙峰中草藥科技有限公司， 江蘇常州213000）

溫度作為環(huán)境因素之一，為影響植物抗寒凍性的重要因子［1］。當(dāng)植物面臨低溫時，會通過一系列響應(yīng)表現(xiàn)以減少低溫帶來的損傷。研究低溫對黃瓜［2］、薏苡［3］、紅蕓豆［4］等的影響，發(fā)現(xiàn)低溫會抑制植物、作物株高、莖粗等生長指標(biāo)的增加，造成生長減緩。研究［5?7］表明，低溫下植物可溶性蛋白含有量增加，抗氧化酶活性提高，以增強(qiáng)抵御低溫的能力，同時，低溫也會造成植物葉綠素含有量下降，丙二醛含有量增加。另外，溫度的改變會使植物基因表達(dá)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生變化，低溫下平歐雜交榛葉片ChaCBF1 表達(dá)量就隨時間延長而升高［8］?？梢?，植物應(yīng)對低溫產(chǎn)生的一系列變化與其抗寒抗冷能力息息相關(guān)。

蒼術(shù)Atractylodes Lancea（Thunb.） DC.作為常用中藥，在臨床和藥用價(jià)值上起到了相當(dāng)重要的作用。茅山為其道地產(chǎn)區(qū)，近年來，低溫寒流天氣頻頻發(fā)生，對植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成造成了一定影響。而有關(guān)茅蒼術(shù)應(yīng)對低溫等不良環(huán)境的研究報(bào)道較少，因此，本實(shí)驗(yàn)通過模擬倒春寒期間低溫脅迫來探究茅蒼術(shù)對低溫的感應(yīng)變化、基因表達(dá)變化，以期為茅蒼術(shù)抗冷性種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)地信息 試驗(yàn)地位于江蘇省常州市新北區(qū)雙峰中草藥基地內(nèi)，地理位置為北緯32°01′28.97″，東經(jīng)119°47′56.60″。本實(shí)驗(yàn)于2018 年12 月28 日將收集的茅蒼術(shù)種苗（產(chǎn)自江蘇茅山地區(qū)），經(jīng)須根修剪、多菌靈浸泡等處理后進(jìn)行種植，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開發(fā)教研室巢建國教授鑒定為菊科植物蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.） DC.的根莖。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 待出苗后且長出5 至7 片葉片時，利用人工培養(yǎng)箱分別對茅蒼術(shù)幼苗進(jìn)行倒春寒溫度 （10、15 ℃） 模擬，并模擬較適宜生長溫度（25 ℃） 作為對照組，每組8 盆，一盆3 株，期間給予正常水分，光照強(qiáng)度均為3 000 lux，光照和黑暗時間均為12 h，實(shí)驗(yàn)前均在自然條件環(huán)境下生長，待脅迫結(jié)束恢復(fù)自然生長。脅迫期間觀察各溫度組種苗生長情況，記錄，進(jìn)行外觀表征測定，并測定脅迫前后與恢復(fù)期如株高、莖粗、葉綠素、丙二醛等一系列生理指標(biāo)，進(jìn)行分析。

1.2 指標(biāo)測定與方法

1.2.1 倒春寒模擬脅迫期間茅蒼術(shù)幼苗植株冷害指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法 觀察并統(tǒng)計(jì)脅迫前后茅蒼術(shù)幼苗的外觀形態(tài)特征，計(jì)算各組冷害指數(shù)。冷害指數(shù)分級如下： 0 級為葉片無枯萎，呈現(xiàn)略微皺縮狀態(tài)；1 級為1～2 片葉片發(fā)黃，呈現(xiàn)輕微萎焉狀態(tài)；2 級為3～4 片葉片發(fā)黃，呈現(xiàn)輕、中度萎焉狀態(tài)；3 級為4 片以上葉片發(fā)黃，呈現(xiàn)中度萎焉狀態(tài)；4 級為葉片出現(xiàn)干枯、倒伏現(xiàn)象，卷曲嚴(yán)重，呈現(xiàn)重度萎焉狀態(tài)。參照Semeniuk［9］、李小玲等［10］研究方法，按公式冷害指數(shù)＝ （∑冷害級數(shù)×相應(yīng)株數(shù)） ／ （最高級數(shù)×總株數(shù)）進(jìn)行計(jì)算，∑冷害級數(shù)×相應(yīng)株數(shù)為各組對應(yīng)冷害級別株數(shù)之和。

1.2.2 倒春寒模擬脅迫期間茅蒼術(shù)幼苗生長指標(biāo)測定方法 測定脅迫前后茅蒼術(shù)幼苗的生長指標(biāo)，具體為株高（cm） 用直尺測定，莖粗（mm） 用游標(biāo)卡尺測定。

1.2.3 倒春寒模擬脅迫期間茅蒼術(shù)幼苗生理指標(biāo)測定方法 選取各組大小、長勢相近的植株葉片，混勻，去除葉脈，剪碎，每組3 個重復(fù)，進(jìn)行以下生理指標(biāo)測定： 過氧化物酶（POD） 和還原型谷胱甘肽（GSH） 含有量均采用試劑盒（北京索來寶生物科技有限公司） 進(jìn)行測定，葉綠素含有量測定用乙醇法，可溶性蛋白含有量測定用考馬斯亮藍(lán)法 （其回歸方程為Y＝0.000 7X＋0.705），丙二醛（MDA） 含有量測定用硫代巴比妥酸法。

1.2.4 倒春寒模擬脅迫期間茅蒼術(shù)幼苗葉片關(guān)鍵酶基因測定方法 分別于脅迫期間的第5、15 天時采集茅蒼術(shù)幼苗葉片，用液氮處理后存放在-80 ℃冰箱中，采用RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京） 有限公司］ 說明書方法提取低溫脅迫期間茅蒼術(shù)葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進(jìn)行PCR 熒光定量測定，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，45個循環(huán)。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)篩選出的內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法（以25 ℃組為參照） 進(jìn)行計(jì)算，對比不同低溫對其關(guān)鍵酶基因表達(dá)量差異，從而進(jìn)行分析。qRT?PCR 引物序列見表1。

表1 qRT?PCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 生長指標(biāo)和生理生化指標(biāo)均利用SPSS 22.0 進(jìn)行單因素差異分析，并應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 倒春寒模擬脅迫期間茅蒼術(shù)幼苗植株情況 實(shí)驗(yàn)前茅蒼術(shù)幼苗葉片均呈完全舒展?fàn)顟B(tài)，處于正常生長期。圖1顯示，經(jīng)低溫脅迫后，茅蒼術(shù)葉片均出現(xiàn)不同程度脫水、變軟、卷曲、皺縮和萎焉等現(xiàn)象，且15 ℃組葉片黃化現(xiàn)象比10 ℃組嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至10 ℃組倒春寒模擬脅迫結(jié)束時，有50%幼苗葉片無枯萎現(xiàn)象，僅有略微皺縮，有25%幼苗葉片表現(xiàn)出輕中度萎焉，僅有12.5%幼苗葉片出現(xiàn)輕微萎焉和重度萎焉表現(xiàn)，其冷害指數(shù)為0.281。至15 ℃組倒春寒模擬脅迫結(jié)束時，12.5% 植株有輕微黃葉，但無明顯枯萎情況，25%植株出現(xiàn)個別黃葉，呈現(xiàn)輕微、中度萎焉狀態(tài)，僅有12.5%植株出現(xiàn)葉片皺縮、卷曲嚴(yán)重，呈重度萎焉狀態(tài)，還伴有倒伏現(xiàn)象，其冷害指數(shù)為0.438。

圖1 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)外觀形態(tài)的影響

2.2 倒春寒模擬脅迫前后茅蒼術(shù)幼苗生長情況 圖2 顯示，通過對比倒春寒模擬脅迫前后的茅蒼術(shù)生長速率表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)各組株高、莖粗生長速率有所差異。15 ℃組茅蒼術(shù)株高、莖粗生長速率和25 ℃組無明顯差異，而10 ℃組茅蒼術(shù)株高、莖粗生長速率明顯下降，且與15、25 ℃組均呈顯著性差異。表明15 ℃處理下茅蒼術(shù)仍能維持正常生長，而10 ℃處理下茅蒼術(shù)株高、莖粗生長受到一定抑制，生長減緩。

圖2 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)株高、莖粗的影響

2.3 生理生化指標(biāo)測定

2.3.1 葉綠素總量測定 圖3 顯示，無論是倒春寒脅迫后期還是恢復(fù)期階段，10 ℃組和25 ℃組葉綠素含有量均呈不斷增加趨勢，而15 ℃組則呈先上升后下降趨勢。經(jīng)脅迫后，15 ℃組增加明顯，與25 ℃組比較增加了5.740%，但無顯著性差異；與10 ℃組比較增加了16.216%，有顯著性差異。而后恢復(fù)正常生長發(fā)現(xiàn)，10 ℃組和15 ℃組同期葉綠素含有量均低于25 ℃組，比較25 ℃組，10 ℃組降低了13.012%，15 ℃組降低了14.760%，且2 組均與其呈顯著性差異。

圖3 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)葉綠素總量的影響

2.3.2 丙二醛含有量測定 圖4 顯示，三組丙二醛含有量變化趨勢各不相同。10 ℃組呈持續(xù)上升情況，15 ℃組表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，25 ℃組則為先降后升情況。經(jīng)低溫脅迫后，發(fā)現(xiàn)15 ℃組丙二醛含有量大大增加，同期約為25 ℃組的4 倍多，且與25 ℃組有顯著性差異，而10 ℃組丙二醛含有量雖然也有所上升，但與25 ℃組不呈顯著性差異。經(jīng)過恢復(fù)后，發(fā)現(xiàn)10 ℃組和25 ℃組丙二醛含有量仍有增加，而15 ℃組丙二醛含有量有所回落，但15 ℃組仍高于10、25 ℃組，同比為10 ℃組的40.759%，同比為25 ℃組的28.919%，且與其他2 組均呈顯著性差異。

圖4 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)丙二醛含有量的影響

2.3.3 過氧化物酶（POD） 活性測定 圖5 顯示，25 ℃組POD 活性為先降后升趨勢，而10、15 ℃組均為先上升后下降趨勢。經(jīng)脅迫后發(fā)現(xiàn)，10 ℃組與25、10 ℃組與15 ℃組均呈顯著性差異，與25 ℃組比較，10 ℃組同期增加了43.678%，與15 ℃組比較，10 ℃組同期降低24.902%；同時，15 ℃組與25 ℃組呈極顯著性差異，與其比較，同期增加了79.456%。經(jīng)恢復(fù)后可見，15 ℃組POD 含有量雖然有所下降，但仍與10 ℃組呈顯著性差異，與25 ℃組呈極顯著性差異。

圖5 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)POD 活性的影響

2.3.4 還原型谷胱甘肽（GSH） 含有量測定 圖6 顯示，10、15 ℃組GSH 含有量始終呈上升趨勢，而25 ℃組呈先下降后上升趨勢。經(jīng)脅迫后發(fā)現(xiàn)，10 ℃組與25 ℃組呈顯著性差異，與25 ℃組比較，10 ℃組同期增加了61.750%，15 ℃組與25 ℃組呈極顯著性差異，與其比較，同期增加了244.057%。經(jīng)恢復(fù)后可見，15 ℃組仍然呈增加走勢，并與10 ℃組呈顯著性差異，與25 ℃組呈極顯著性差異。

圖6 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)GSH 含有量的影響

2.3.5 可溶性蛋白質(zhì)含有量測定 圖7 顯示，10、25 ℃組可溶性蛋白質(zhì)含有量均為先降低后上升趨勢，而15 ℃組則是先增加后下降情況。經(jīng)脅迫后發(fā)現(xiàn)，15 ℃組可溶性蛋白質(zhì)含有量大幅增加，且與10、25 ℃組均有顯著性差異，同比10 ℃組增加了111.581%，同比25 ℃組增加了85.661%。而后經(jīng)過短暫恢復(fù)后可見，10 ℃組和25 ℃組可溶性蛋白質(zhì)含有量都有所上升，15 ℃組則有所降低，此時15 ℃組和25 ℃組差異不明顯，但其與10 ℃組有顯著性差異。

圖7 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)可溶性蛋白質(zhì)含有量的影響

2.4 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)葉片關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響 圖8A 顯示，經(jīng)脅迫5 d 后，25 ℃組法尼基焦磷酸合酶（FPPS） 基因表達(dá)量大幅上調(diào)，而10 ℃組和15 ℃組FPPS基因表達(dá)量均有所下降。表明低溫會使茅蒼術(shù)葉片F(xiàn)PPS基因表達(dá)受到抑制。而后經(jīng)15 d 脅迫后，25 ℃組FPPS基因表達(dá)量變幅不大，15 ℃組FPPS基因表達(dá)量仍呈持續(xù)下降趨勢，10 ℃組則有所回升。圖8B 顯示，經(jīng)5 d 脅迫后，3組3?羥基?3?甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMGR） 基因表達(dá)量均為上升情況，其中10 ℃組增幅明顯，表明低溫使茅蒼術(shù)葉片HMGR基因表達(dá)上調(diào)，而后經(jīng)15 d 脅迫后，與25 ℃組比較，10、15 ℃組HMGR基因表達(dá)量均有所下降，表明HMGR基因與脅迫時間有緊密聯(lián)系。

圖8 倒春寒低溫脅迫對茅蒼術(shù)葉片關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，與25 ℃組比較，15 ℃組茅蒼術(shù)幼苗初期受冷影響表現(xiàn)不明顯，只有少數(shù)植株有輕微冷害和重度冷害表現(xiàn)。而10 ℃組幼苗受冷害影響較明顯，表明溫度越低，受冷害程度越明顯。結(jié)果表明溫度越低，茅蒼術(shù)萎焉、發(fā)黃越嚴(yán)重［11?12］?？梢姡~片受冷程度表現(xiàn)可作為評判植物冷害程度最直觀的依據(jù)。植物的生長情況一定程度上可反映其對周遭環(huán)境的適應(yīng)性，以及自身抗性的強(qiáng)弱程度。本實(shí)驗(yàn)中，10 ℃、15 ℃組茅蒼術(shù)幼苗相對25 ℃組而言，株高、莖粗生長速率均有所下降，且溫度越低，其生長速率受抑制越顯著，表明低溫確實(shí)會使植物生長受到一定抑制［13?14］。但目前低溫對藥用植物生長的影響研究和報(bào)道甚少，其結(jié)論和作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究、考證。

溫度為影響植物體內(nèi)光合色素變化的主要因素之一，當(dāng)植物遇到逆境時，其葉綠素含有量會作出相應(yīng)變化［15?16］。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)低溫脅迫后，15 ℃組葉綠素含有量高于25 ℃組，而10 ℃組則低于25 ℃組，可能與低溫下植物體內(nèi)葉綠素合成受阻有關(guān)，推測在15 ℃處理下，茅蒼術(shù)體內(nèi)葉綠素合成還未達(dá)到抑制溫度［17?18］，但與歐俊梅等［19］研究結(jié)果是相反的，表明不同植物應(yīng)對低溫時，其葉綠素總量響應(yīng)變化各異。

丙二醛是評價(jià)植物應(yīng)對逆境時的受損程度和體現(xiàn)自身抗性的主要指標(biāo)［20］。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)遭受低溫脅迫后，2 低溫組丙二醛含有量相較25 ℃組均有所增加，并隨溫度下降而降低。表明低溫對茅蒼術(shù)幼苗造成了一定傷害，同時，丙二醛含有量隨溫度降低而下降，可能與植株的承受范圍有關(guān)，也可能與細(xì)胞膜內(nèi)代謝體系暫時性失衡有關(guān)［21?23］。經(jīng)恢復(fù)后，各組丙二醛含有量有所降低，但15 ℃組仍處于較高水平，表明溫度越高，對茅蒼術(shù)傷害越大，但其可通過自身調(diào)節(jié)以恢復(fù)至正常水平。

低溫下，植物會產(chǎn)生一系列活性氧等有害物質(zhì)，此時，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性來減少氧化損傷［24］。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)茅蒼術(shù)感受低溫時，其POD 活性和GSH 含有量均有所上升，表明茅蒼術(shù)對低溫有一定的耐受力和抗性，POD和GSH 兩者在抵御低溫時起到了重要作用［25］。同時，較25 ℃組而言，溫度越低，其POD 活性和GSH 含有量增幅也隨之減少，表明隨著溫度的降低，其酶活力會逐漸受到抑制，在一定程度上可通過調(diào)節(jié)酶活性來增強(qiáng)其抗性［26］。

可溶性蛋白質(zhì)為維持植物滲透平衡的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，其具有一定保水能力。本實(shí)驗(yàn)中，不管是低溫脅迫后還是經(jīng)恢復(fù)生長后，與25 ℃組比較，15 ℃組可溶性蛋白質(zhì)含有量大大增加，而10 ℃組則有所下降，表明溫度與可溶性蛋白質(zhì)含有量呈正相關(guān)，表明茅蒼術(shù)可承受10 ℃以上溫度，隨著溫度的降低，其保水能力也逐漸減弱。在一定范圍內(nèi)，可溶性蛋白質(zhì)含有量的升高，推測與新蛋白質(zhì)或抗冷性蛋白質(zhì)合成有關(guān)［27?28］。也有研究［29］表明可溶性蛋白質(zhì)也可反映植株抗性的強(qiáng)弱，關(guān)于其對低溫的響應(yīng)變化機(jī)制仍需深入研究。

據(jù)悉，F(xiàn)PPS 和HMGR 是三萜類成分合成的限速酶［30］。本實(shí)驗(yàn)中，低溫脅迫初期時，茅蒼術(shù)葉片中FPPS 表達(dá)量均有所下調(diào)，且溫度越低，下調(diào)越明顯，表明茅蒼術(shù)葉片F(xiàn)PPS 表達(dá)量受抑制程度與溫度有緊密聯(lián)系［31］。隨著低溫的延長，10 ℃組FPPS 表達(dá)量又有所回升，推測與脅迫程度不斷加重有關(guān)，具體原因有待探究。本實(shí)驗(yàn)中，茅蒼術(shù)葉片HMGR 表達(dá)量經(jīng)低溫脅迫均為先升后降趨勢，且溫度越低，表現(xiàn)越明顯，在一定范圍內(nèi)，茅蒼術(shù)葉片HMGR 表達(dá)量受低溫影響而上調(diào)，隨后下降，可能與其脅迫程度和抗冷能力有關(guān)［32］。

總體而言，低溫下茅蒼術(shù)出現(xiàn)萎焉、變薄等現(xiàn)象且生長遲緩，葉片黃化，低溫對其造成一定傷害。但茅蒼術(shù)仍可通過提高酶活系統(tǒng)，調(diào)節(jié)可溶性蛋白質(zhì)含有量，協(xié)調(diào)FPPS、HMGR基因共同作用來抵御低溫，具有一定耐冷性。