呂品田 段昕波

（河北省人民醫(yī)院腫瘤二科， 河北石家莊050000）

黃精為百合科多年生草本植物黃精、滇黃精和多花黃精的干燥根莖，具有健脾、潤(rùn)肺、益腎、補(bǔ)氣、養(yǎng)陰之功效［1］。研究表明，黃精多糖是黃精的主要的活性成分，具有改善記憶力、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖血脂、抗炎、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力及抗腫瘤等作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖可以促進(jìn)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠溶血素的形成，提高胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，改善免疫功能［3］；進(jìn)一步對(duì)黃精多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酸性多糖的免疫活性高于中性多糖［4］。黃精多糖也可以顯著抑制H22 肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制與激活caspase 系統(tǒng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及阻滯腫瘤細(xì)胞于G0／G1期，進(jìn)而影響細(xì)胞周期分布等有關(guān)［5］；此外，黃精多糖與順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，可以更好的抑制H22 肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，并降低順鉑毒性［6］。黃精多糖對(duì)胃癌的研究報(bào)道較少，且考慮到抗癌作用和免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)性，本研究以MFC 胃癌荷瘤小鼠為模型，觀察黃精多糖的體內(nèi)抑瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 BALB／c 小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，SPF級(jí)，雌、雄各半，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2012?0001，購(gòu)自北京維通利華公司；自由攝食、飲水，分籠飼養(yǎng)，濕度45%～55%，溫度20～25 ℃。MFC 胃癌細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及試劑 黃精多糖由本實(shí)驗(yàn)室制備［7］，采用水提、醇沉法，純度＞85.0%；復(fù)方環(huán)磷酰胺片 （批號(hào)160706，上海華聯(lián)制藥有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；TNF?α、IL?2、IL?6 檢測(cè)試劑盒（南京建成生物研究所）；RNA 提取試劑盒、RR047A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ（日本TaKaRa 公司）。

1.3 儀器 SW?CJ?2FD 超凈工作臺(tái)（上海博迅生物科技有限公司）；BPN?RHP／RWP 型CO2培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；ELx800TM酶標(biāo)儀 （美國(guó)Bio Tek 公司）；760CRT 紫外?可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精科儀器有限公司）；CFX96 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio?Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 取凍存于液氮中的MFC 胃癌細(xì)胞，在37 ℃水浴中快速解凍，轉(zhuǎn)移至離心管后加入DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），1 000 r／min 離心3 min，棄上清；加入DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），常規(guī)條件培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將 MFC 胃癌細(xì)胞濃度調(diào)整至1.5×106／mL，于BALB／c 小鼠腋下接種，0.2 mL／只，當(dāng)瘤塊直徑達(dá)到0.5 cm 時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)（剔除體積過(guò)小或過(guò)大者）。40 只篩選合格小鼠隨機(jī)分為模型組、環(huán)磷酰胺組（20 mg／kg）、黃精多糖高劑量組（400 mg／kg） 和黃精多糖低劑量組（100 mg／kg），另隨機(jī)選取10 只健康BALB／c 小鼠作為對(duì)照組；灌胃給藥，連續(xù)21 d，對(duì)照組及模型組灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 抑瘤率及臟器指數(shù)測(cè)定 末次給藥24 h 后，摘眼球取血，分離血清，凍存?zhèn)溆茫活i椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌條件下剖取瘤塊及脾臟、胸腺，精密稱(chēng)定質(zhì)量后，分別計(jì)算抑瘤率及臟器指數(shù)。抑瘤率＝ ［（模型組瘤重?給藥組瘤重） ／模型組瘤重］ ×100%，臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK 細(xì)胞活性測(cè)定 頸椎脫臼法處死小鼠，無(wú)菌條件下剖取脾臟，稱(chēng)定質(zhì)量后放于200 目尼龍網(wǎng)上，置于35 mm 組織培養(yǎng)皿中 （內(nèi)含EZ?SepTM 小鼠淋巴細(xì)胞分離液）。通過(guò)輕輕碾壓脾臟，使其分散成單細(xì)胞，于RPMI1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分別采用MTT 法和乳酸脫氫酶（LDH） 釋放法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK 細(xì)胞活性。

2.4 血清細(xì)胞因子測(cè)定 取凍存的血清，采用ELISA 法檢測(cè)TNF?α、IL?2 和IL?6 水平，具體操作方法參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作指南。

2.5 脾臟TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)測(cè)定 取脾臟組織20 mg，加入液氮，充分研磨，TRIzol 法提取總RNA；經(jīng)RR047 A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃冰箱中保存。采用SYBR 法在CFX96 熒光定量PCR儀中檢測(cè)TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)，20 μL 反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為95 ℃、5 min 預(yù)變性，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)，系統(tǒng)自帶軟件分析溶解曲線。以β?actin為內(nèi)參，通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由大連生物工程技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠抑瘤作用的影響 灌胃給予荷瘤小鼠黃精多糖21 d 后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠瘤重增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃精多糖高、低劑量組瘤重均降低（P＜0.05），抑瘤率分別為37.71、22.22%。見(jiàn)表2。

3.2 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)均降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃精多糖低、高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)增加（P＜0.05）。

表2 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠抑瘤作用的影響（， n＝10）

表2 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠抑瘤作用的影響（， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

表3 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響（， n＝10）

表3 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響（， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.3 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活性的影響 灌胃給予MFC 胃癌荷瘤小鼠黃精多糖21 d后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK 細(xì)胞活性均降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃精多糖低、高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活性增加（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活性的影響（， n＝10）

表4 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK細(xì)胞活性的影響（， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.4 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的影響 灌胃給予MFC 胃癌荷瘤小鼠黃精多糖21 d 后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，除黃精多糖低劑量組小鼠血清TNF?α、IL?6 水平無(wú)變化外（P＞0.05），其余各組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平增加（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平的影響（， n＝10）

表5 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平的影響（， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

3.5 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的影響 灌胃給予MFC 胃癌荷瘤小鼠黃精多糖21 d 后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)均增加（P＜0.05），而黃精多糖高、低劑量組小鼠脾臟TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)均降低（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟TLR4、 MyD88、 NF?κB mRNA 表達(dá)的影響（， n＝10）

表6 黃精多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟TLR4、 MyD88、 NF?κB mRNA 表達(dá)的影響（， n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

4 討論

在全球范圍內(nèi)，胃癌位于惡性腫瘤發(fā)病率的第4 位，發(fā)病率高、生存率低是其主要特征；而在我國(guó)，胃癌發(fā)病率雖有所下降，但仍高居第2 位，在各類(lèi)癌癥引起的死亡原因中居于前列［8］。目前常用的治療胃癌手段療效不理想，5 年生存率僅為25%～30%［9］。抗腫瘤化療藥物長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥及不良反應(yīng)，而中藥因其療效確切、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤的治療中得到越來(lái)越多的關(guān)注［10］。近年來(lái)，免疫類(lèi)中藥多糖如黨參多糖、刺五加多糖等因其具有不良反應(yīng)小、抗腫瘤活性和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等特點(diǎn)逐漸引起人們的重視［11?12］。在本研究中，觀察到黃精多糖高、低劑量組瘤重均顯著降低，抑瘤率分別為37.71%、22.22%；同時(shí)，黃精多糖也可以增加模型小鼠的脾臟指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)及NK 細(xì)胞活性；以上結(jié)果表明，黃精多糖具有抑制MFC 胃癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，該作用與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

免疫系統(tǒng)是機(jī)體主要的腫瘤防御系統(tǒng)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNF?α、IL?2 和IL?6 等細(xì)胞因子是機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗癌作用的主要參與者［13］。TNF?α 對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性，而能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞溶解和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［14］。IL?2 由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，具有誘導(dǎo)LAK 細(xì)胞生成，參與細(xì)胞免疫，增強(qiáng)NK、CTL 細(xì)胞殺傷活性，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞分泌TNF、IL?4 等作用，被譽(yù)為免疫系統(tǒng)抗腫瘤的關(guān)鍵蛋白和核心調(diào)控因子［15］。IL?6 由活化的成纖維細(xì)胞和T 細(xì)胞生成，可以促進(jìn)NK 細(xì)胞裂解功能的增強(qiáng)；IL?6 與IL?2 的水平可間接反映機(jī)體免疫功能和腫瘤的進(jìn)展情況［16］。研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)腫瘤患者的預(yù)后與血清IL?6、IL?2 水平呈正相關(guān)，血清IL?6、IL?2 水平檢測(cè)有利于腫瘤的預(yù)后及早期診斷［17］。本研究結(jié)果證實(shí)，除黃精多糖低劑量組小鼠血清TNF?α 和IL?6 水平無(wú)明顯增加外，其余各組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平均有明顯增加，表明黃精多糖可以通過(guò)促進(jìn)免疫因子的表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

近年研究表明，許多中藥抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮均與TLRs 信號(hào)通路有關(guān)［18］。在所有TLRs 信號(hào)通路中，TLR4／NF?κB 信號(hào)通路在中藥多糖主導(dǎo)的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用中有重要作用，且有研究證實(shí)，黃精多糖可以抑制TLR4／NF?κB 信號(hào)通路［19］。鑒于上述原因，本研究在確認(rèn)了黃精多糖具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了黃精多糖對(duì)TLR4／NF?κB 信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響。TLR4 在各種細(xì)胞中均可表達(dá)，其被活化后可促進(jìn)免疫因子的產(chǎn)生；MyD88 是TLRs 大多數(shù)信號(hào)通路中的接頭分子，TLR4 能夠通過(guò)MyD88 激活NF?κB，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫因子的分泌；NF?κB 是理想的免疫信號(hào)通路調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，處于TLRs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游樞紐位置［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃精多糖高、低劑量組小鼠脾臟TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)明顯降低，表明黃精多糖具有抑制TLR4／NF?κB信號(hào)通路的作用。TLR4／NF?κB 信號(hào)通路的激活受阻可能是黃精多糖在MFC 胃癌荷瘤小鼠體內(nèi)發(fā)揮抑瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用的潛在機(jī)制之一，但深入機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。