劉宜峰 楊 華 曹 磊 鄭楊楊

（海南省中醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科， 海南?？?70203）

食管癌是世界上最致命的惡性腫瘤之一，在過去的幾十年里，食管癌發(fā)病率急劇上升。盡管食管癌患者的管理和治療有所改善，但總體的5 年生存率（10%） 和5 年食管癌切除術(shù)后生存率（15%～40%） 仍然很差［1］。因此，尋找更有效和合適的治療劑，以改善食管癌患者的存活是十分必要的。款冬花藥材是菊科植物款冬Tussilago farfaraL.的干燥花蕾，具有潤肺下氣、止咳化痰的功效，可用于治療新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血［2］。作為款冬花的活性成分之一，款冬花多糖具有抗腫瘤作用［3］，能夠抑制肺腺癌的增殖，誘導其凋亡［4］。然而，款冬花多糖對食管癌的影響鮮有報道。microRNA 是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在食管癌等多種癌癥中異常表達［5?6］。miR?99a 被廣泛報道在多種癌癥中具有抑癌作用。miR?99a 的表達在子宮內(nèi)膜癌組織中被顯著抑制，miR?99a 過表達抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤生長，阻斷G1／S 期轉(zhuǎn)變，誘導細胞凋亡。通過miR?99a 抑制PI3K／Akt／mTOR 信號通路，抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展［7］。在 101 例食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC） 手術(shù)組織樣本和3 個細胞系中，證實了miR?99a／100 的下調(diào)，miR?99a 和miR?100 的過表達通過誘導細胞株凋亡，抑制細胞增殖［8］。PI3K／Akt／mTOR 通路在細胞生物學中具有重要的調(diào)控作用，包括翻譯、轉(zhuǎn)錄和自噬，該通路的失調(diào)參與食管癌的發(fā)病機制、發(fā)展、預后［9］。姜黃素通過上調(diào)miR?145 表達和抑制PI3K／Akt／mTOR 通路抑制喉鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞周期阻滯和凋亡［10］。姜黃素的干預可以抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤SO?Rb50 和Y79 細胞的存活、菌落形成、遷移和侵襲能力，誘導細胞凋亡，其對視網(wǎng)膜母細胞瘤的抗腫瘤活性是通過上調(diào)miR?99a，從而抑制JAK／STAT 通路來實現(xiàn)的［11］。姜黃素上調(diào)miR?99a 表達，抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展，但是關于款冬花多糖是否通過調(diào)控miR?99a、PI3K／Akt 信號通路來影響食管癌的增殖、遷移和侵襲，這方面的資料鮮見報道。因此，本研究以食管癌細胞Eca109 為對象，評價款冬花多糖在細胞增殖、遷移和侵襲中的作用，并結(jié)合miR?99a 和PI3K／Akt 信號通路，探索其潛在的分子機制。

1 材料

1.1 細胞 食管癌細胞Eca109 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 中藥款冬花（批號1903203） 由海南壽南山參業(yè)有限公司生產(chǎn)，海南新星參茸藥業(yè)有限公司供貨；RPMI?1640 培養(yǎng)基（批號31870082） 購自美國Gibco 公司；胎牛血清（批號SH30396） 購自美國Hyclone 公司；RIPA裂解液 （批號 R0278）、噻唑藍 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） （批號M2128） 購自美國Sigma 公司；Matrigel 基質(zhì)膠（批號356234） 購自美國BD 公司；β 肌動蛋白（β?actin） 抗體 （批號4970）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix metalloprotease 2，MMP2） （批號4022）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （Matrix metalloprotease 9，MMP9） （批號3852）、細胞周期蛋白D1 （Cyclin D1） （批號2978）、磷酸化磷脂酰肌醇?3 激酶（p?PI3K） （批號17366）、磷酸化蛋白激酶B （p?Akt） （批號4058） 抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記二抗（批號ZDR?5306） 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Tris?HCl?Tween 緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）（批號C520009?0500） 購自上海生工生物工程公司；TRIzol（批號15596026）、Lipofectamine 2000 （批號11668019） 購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號4366596） 購自美國Thermo Fisher 公司，miR?con、miR?99a、anti?miR?con、anti?miR?99a 購自上海吉瑪生物公司。

2 方法

2.1 款冬花多糖制備 款冬花藥材粉碎成粉末，取過60目篩的藥材粉末，按趙鵬等［12］的方法超聲提取款冬花多糖。料液比1 ∶27，溫度68 ℃，時間36 min，提取3 次。采用苯酚?硫酸法進行測定，多糖提取率＝ （款冬花多糖質(zhì)量／款冬花藥材質(zhì)量） ×100%，多糖提取率為1.97%。

2.2 細胞培養(yǎng)與分組 Eca109 細胞加入RPMI?1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37 ℃、3% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%融合度時，胰酶消化3～5 min，以1 ∶2 的比例接種傳代。將Eca109 細胞隨機分為對照組（不加任何處理的Eca109 細胞）、款冬花多糖組（10、20、40、80、160 mg／L 款冬花多糖），款冬花多糖處理Eca109 細胞24 h。

2.3 MTT 法檢測Eca109 細胞存活 使用胰酶消化Eca109細胞，將細胞濃度調(diào)整為5×104／mL，接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h?？疃ǘ嗵翘幚?4 h 后，棄去原有培養(yǎng)液，以100 μL ／孔加入MTT 溶液（5 g／L），培養(yǎng)4 h，棄去原有液體，加入200 μL／孔的二甲基亞砜（DMSO），置37 ℃搖床持續(xù)10 min，上機檢測細胞吸光度值（OD），檢測波長設為490 nm。細胞存活率＝ ［（OD給藥組／OD對照組）］ ×100%。

2.4 Transwell 法檢測Eca109 細胞遷移和侵襲 Eca109 細胞遷移能力測定： 使用不含血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基稀釋細胞濃度為5×105／mL，吸取100 μL 于上室；下室加入含血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基500 μL 作為趨化因子，培養(yǎng)24 h，棉簽拭去未穿膜的Eca109 細胞，4% 甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，記錄遷移細胞數(shù)。Eca109 細胞侵襲能力測定，取Matrigel 膠100 μL 加入不含血清RPMI?1640 培養(yǎng)基500 μL，混勻后添加50 μL 于上室，靜置3～4 h，后續(xù)操作與Eca109 細胞遷移能力測定相同。

2.5 Western blot 檢測MMP2、MMP9、Cyclin D1、p?PI3K、p?Akt 蛋白表達 在冰上使用RIPA 裂解液提取Eca109 細胞蛋白，蛋白加入上樣緩沖液，變性后，進行10%的十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳 （Sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS?PAGE），轉(zhuǎn)至PVDF膜，之后加5%脫脂奶粉，封閉1 h。加入一抗MMP2 （1 ∶1 000）、MMP9 （1 ∶1 000）、Cyclin D1 （1 ∶1 000）、p?PI3K （1 ∶1 000）、p?Akt （1 ∶1 000），4 ℃過夜。TBST 溶液洗膜3 次，15 min／次，加入二抗（1 ∶5 000） 孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次，15 min／次，加入化學發(fā)光液避光顯色，β?actin 作為內(nèi)參蛋白，分析MMP2、MMP9、Cyclin D1、p?PI3K 和p?AKT 蛋白表達。

2.6 RT?PCR 檢測miR?99a 表達 使用TRIzol 試劑提取Eca109 細胞總RNA，cDNA 的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，以cDNA 為模板，進行擴增。引物序列miR?99a 正向 5′?AGAGCAACCCGTAGATCCGA?3′，反向 5′?CAGTG CAGGGTCCGAGGT?3′。U6 正向5′?GCGCGTCGT?GAAGCGTTC?3′，反向5′?GTGCAGGGTCCGAGGT?3′。miR?99a 的表達量以2-ΔΔCt法計算。

2.7 細胞轉(zhuǎn)染 Eca109 細胞以1×105／mL 接種于6 孔板，待其70%融合時，按照Lipofectamine 2000 試劑說明書的指示，將miR?con、miR?99a、anti?miR?con、anti?miR?99a 轉(zhuǎn)染入Eca109 細胞。轉(zhuǎn)染anti?miR?con、anti?miR?99a 的細胞以80 mg／L 款冬花多糖處理24 h。

2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（） 表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用SNK?q 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對Eca109 細胞存活率的影響 如表1 所示，與對照組比較，10、20、40、80、160 mg／L 款冬花多糖減少Eca109 細胞存活率（P＜0.05）。

表1 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 增殖的影響（， n＝9）

表1 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 增殖的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

3.2 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對Eca109 細胞遷移、侵襲的影響 與對照組比較，40、80 mg／L 款冬花多糖抑制Eca109 細胞遷移、侵襲（P＜0.05），抑制Eca109 細胞中MMP2、MMP9 蛋白表達（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 Western Blot 檢測MMP2、MMP9 蛋白的表達

表2 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖抑制食管癌細胞Eca109 遷移和侵襲（， n＝9）

表2 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖抑制食管癌細胞Eca109 遷移和侵襲（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

3.3 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 中miR?99a 表達的影響 如表3 所示，40、80 mg／L 款冬花多糖較對照組增加Eca109 細胞內(nèi)miR?99a 的表達 （P＜0.05）。

表3 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 中miR?99a 表達的影響（x ±s， n＝9）

3.4 過表達miR?99a 抑制食管癌細胞Eca109 增殖、遷移和侵襲 如表4 所示，轉(zhuǎn)染后miR?99a 表達高于miR?con 組（P＜0.05），表明成功構(gòu)建過表達miR?99a 的Eca109 細胞。與miR?con 組比較，過表達miR?99a 降低Eca109 細胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達（P＜0.05），減少細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 Western Blot 檢測高表達 miR?99a 時CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白的表達

表4 過表達miR?99a 對食管癌細胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表4 過表達miR?99a 對食管癌細胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與miR?con 組比較，*P＜0.05。

3.5 低表達miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較，款冬花多糖促進miR?99a 表達，抑制Cyclin D1、MMP2、MMP9表達，降低細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)（P＜0.05）。與款冬花多糖＋anti?miR?con 組比較，款冬花多糖＋anti?miR?99a 組減少miR?99a 表達 （P＜0.05），提高Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達（P＜0.05），并增加細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)（P＜0.05）。見圖3、表5。

3.6 低表達miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 PI3K／AKT 信號通路的影響 與對照組比較，款冬花多糖減少Eca109 細胞中p?PI3K、p?Akt 蛋白表達（P＜0.05）；相較于款冬花多糖＋anti?miR?con 組，款冬花多糖＋anti?miR?99a 組提高Eca109 細胞中p?PI3K 和p?Akt 蛋白表達（P＜0.05）。見圖4、表6。

4 討論

圖3 Western Blot 檢測Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達

食管癌是消化道常見的原發(fā)性惡性腫瘤。2018 年，按發(fā)病率（572 034 例新發(fā)病例） 和總死亡率（508 585 例死亡病例） 排名，食管癌居于全球癌癥的第7 位，大約70%的病例發(fā)生于男性，全世界的發(fā)病率和死亡率在兩性之間存在2～3 倍的差異［13］。按區(qū)域劃分，東亞的發(fā)病率最高，中國和蒙古的發(fā)病率在世界上排名前5［13］。食管癌最常見的2 種組織學亞型為ESCC 和食管腺癌（oesophageal adeno?carcinoma，EAC）［14］。目前食管癌的治療包括手術(shù)、化療和放化療，然而所有這些方法對該病的影響有限［15］，因此，有必要尋找新的食管癌治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)款冬花多糖對食管癌細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用，作用機制與調(diào)控miR?99a／PI3K／Akt 通路有關。

圖4 Western Blot 檢測p?PI3K 和p?Akt 蛋白的表達

款冬花是我國傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，含有黃酮類、多糖類、生物堿類、酚酸類等化學成分［16］?？疃ǘ嗵翘崛∽钥疃?，具有抗氧化［17］、抗腫瘤［18］等活性。Safonova 等［19］對Lewis 肺癌C57Bl／6 小鼠進行的實驗表明，在常規(guī)順鉑／紫杉醇復合化療中添加款冬花多糖可減輕抗腫瘤治療引起的中性粒細胞減少，提高治療效率；款冬花多糖對成粒細胞的刺激作用可與重組腦脊液神經(jīng)源相媲美。Qu 等［20］從款冬花花蕾中分離得到一種多糖TFPB1，TFPB1 由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，比例為13 ∶13 ∶1 ∶7 ∶12；體外實驗發(fā)現(xiàn)TFPB1能抑制非小細胞肺癌A549 細胞的增殖，誘導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，款冬花多糖明顯抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲，顯現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用，這些發(fā)現(xiàn)提供了一種治療人類食管癌的潛在策略。

表5 低表達miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表5 低表達miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與款冬花多糖＋anti?miR?con 組比較，＃P＜0.05。

表6 低表達miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 中p?PI3K 和p?Akt 蛋白表達的影響（， n＝9）

表6 低表達miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對食管癌細胞Eca109 中p?PI3K 和p?Akt 蛋白表達的影響（， n＝9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與款冬花多糖＋anti?miR?con 組比較，＃P＜0.05。

數(shù)據(jù)顯示，款冬花多糖可以提高Eca109 細胞miR?99a表達，猜想款冬花多糖抑制食管癌功能與調(diào)控miR?99a 表達密切相關。miRNA 作為癌基因或腫瘤抑制因子參與多種類型癌癥的調(diào)控，在癌癥的診斷和治療中發(fā)揮關鍵作用。miRNA 在食管癌中的重要性也引起了越來越多的關注。然而，大多數(shù)miRNA （包括miR?99a） 在食管癌中的調(diào)節(jié)機制仍不清楚。miR?99a 在多種人類惡性腫瘤中下調(diào)，被報道為一種潛在的腫瘤抑制因子［21］。資料顯示，ESCC 組織中miR?99a 的表達較低；過表達miR?99a 顯著抑制ESCC 細胞增殖、遷移、侵襲和上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial?Mesen?chymal Transition，EMT），并下調(diào)EMT 相關轉(zhuǎn)錄因子基質(zhì)金屬蛋白酶 （Matrix metalloproteases，MMPs），包括MMP2、MMP7 和MMP13，表明ESCC 中miR?99a 的缺失促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［22］。miR?99a 在非小細胞肺癌組織中下調(diào)，與非小細胞肺癌患者的晚期和腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關；miR?99a 過表達在體外抑制了細胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［23］。與正常組織和正常肝細胞比較，肝癌組織樣品和細胞中miR?99a 表達分別顯著降低，Transwell 測定結(jié)果顯示miR?99a 可抑制肝癌細胞的侵襲和遷移［24］。本實驗也有同樣的發(fā)現(xiàn)，即高表達miR?99a明顯減少Eca109 細胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達、細胞存活率、遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)，為miR?99a 的抑癌作用提供了新的證據(jù)。同時，低表達miR?99a 部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對細胞增殖、遷移、侵襲、Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達的抑制作用，說明款冬花多糖可能通過上調(diào)miR?99a 表達來發(fā)揮食管癌抑制作用。

PI3K／Akt 通路在多種人類癌癥中被激活，并在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，如ESCC［25］。PI3K／Akt 信號通路參與食管癌的發(fā)生發(fā)展，抑制其活性可以有效抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲［26?28］?？疃ǘ嗵荰FPB1 下調(diào)p?Akt 和Bcl?2 的表達，上調(diào)caspase?3、Bax 等蛋白的表達，TFPB1 的抗增殖和抗凋亡作用部分依賴于Akt 信號通路的抑制［20］。miR?99a 過表達部分通過抑制PI3K／Akt／mTOR 通路活性誘導子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲的抑制作用和細胞凋亡［7］。本研究中，款冬花多糖明顯抑制p?PI3K 和p?Akt蛋白表達，這種抑制作用被低表達miR?99a 部分逆轉(zhuǎn)，說明PI3K／Akt 信號通路影響食管癌進程，調(diào)控miR?99a 表達并抑制PI3K／Akt 信號通路活性可能是款冬花多糖抑制食管癌的重要途徑之一。

總之，目前的結(jié)果證明了款冬花多糖的抗食管癌特性。此外，款冬花多糖顯著增強miR?99a 表達，并進一步抑制／PI3K／Akt 信號傳導。