宋 程 陳存武 孫傳伯 韓邦興 何曉梅*

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院， 安徽六安237012； 2.安徽省石斛產(chǎn)業(yè)化開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心， 安徽六安237012； 3.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室， 安徽六安237012）

雪菊Sanvitaliaprocumbens Lam.又名蛇目菊、雙色金雞菊，為菊科金雞菊屬一年生草本植物。雪菊原產(chǎn)于美國(guó)中西部地區(qū)，在我國(guó)部分地區(qū)作為保健茶和藥材大面積栽培。野生雪菊生長(zhǎng)在昆侖山脈海拔3 000 m 雪線境內(nèi)，花期短，產(chǎn)量少。雪菊作為藥用菊花的一種，其中黃酮類表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化、清熱解毒、降壓、降脂等功效［1?2］。目前，關(guān)于雪菊化學(xué)成分的研究主要集中在總黃酮、總皂苷、總多糖和氨基酸［3］，還有研究報(bào)道雪菊與菊科杭白菊、貢菊中綠原酸、木樨草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩岷烷纹ぼ諑追N藥用成分的差別［4］。2015 年版《中國(guó)藥典》 “菊花” 項(xiàng)對(duì)菊花干燥品中綠原酸、木樨草苷和3，5?二咖啡酰奎寧酸的最低含有量也有明確限定［5］。然而，雪菊中類黃酮含有量豐富，且化學(xué)組成各異，其主要化學(xué)成分并不限于藥典規(guī)定。雪菊相對(duì)其他品種菊花色澤更深，暗示可能積累較多的原花青素和花色苷。本實(shí)驗(yàn)在已研究4 種成分的基礎(chǔ)上，增加對(duì)雪菊中色素合成前體兒茶素、表兒茶素以及二氫楊梅素、楊梅素的檢測(cè)，以期建立新的雪菊活性成分評(píng)價(jià)指標(biāo)。利用反相色譜法檢測(cè)雪菊與幾種商品菊花中咖啡酸衍生物和黃酮類成分的含有量，以期用于菊花的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 材料 雪菊1 號(hào)至雪菊5 號(hào)于2016 年7 至9月分別采摘于新疆皮山縣康克鄉(xiāng)、克里陽(yáng)鄉(xiāng)、策勒縣博斯坦鄉(xiāng)、策勒鎮(zhèn)和墨玉縣芒來(lái)鄉(xiāng)，生長(zhǎng)地海拔平均在1 200～2 500 m，經(jīng)皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院何曉梅副教授鑒定為菊科金雞菊屬蛇目菊Sanvitaliaprocumbens Lam.；貢菊、杭白菊、胎菊和黃金菊購(gòu)于市場(chǎng)，產(chǎn)地分別為安徽黃山、浙江杭州、浙江杭州和湖北荊州，見(jiàn)圖1。干菊花經(jīng)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)研磨成粉，室溫避光、干燥儲(chǔ)存。

圖1 不同產(chǎn)地樣品Fig.1 Samples from different growing areas

1.2 儀器與試劑 Agilent 1260 系列高效液相色譜儀、Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（美國(guó)Agilent 公司）；Milli?Q Advantage A10 超純水儀（德國(guó)默克密理博有限公司）；RE?52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SB?5200DTD 型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。乙腈、甲醇（色譜級(jí)，美國(guó)Tedia 公司）；甲酸（色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。綠原酸、槲皮苷對(duì)照品 （純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；3，5?二咖啡?？鼘幩帷⒛鹃夭蒈諏?duì)照品（純度≥98%，成都曼斯特生物科技公司）。兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素和楊梅素對(duì)照品［純度≥99%，西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 精密稱取雪菊和菊花粉末各0.25 g，置于圓底燒瓶中，加入70% 甲醇25 mL，超聲處理（120 W，40 kHz） 40 min，放冷，搖勻，濾過(guò)。續(xù)濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2.5 mL 70%甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸、兒茶素、表兒茶素、二氫楊梅素、木樨草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩?、楊梅素、槲皮苷各1 mg，溶于甲醇分別制備成1、1、1、0.1、0.5、1、0.1、1 mg／mL的對(duì)照品貯備液。每種對(duì)照品貯備液依次稀釋不同倍數(shù)，配成不同濃度梯度的對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件 采用Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%A；5～20 min，10%～15% A；20～25 min，15%～20%A；25～40 min，20%～25% A；40～55 min，25%～60%A；55～60 min，60%～5% A）；體積流量0.5 mL／min；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同濃度的對(duì)照品貯備液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品含有量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 分別稱取對(duì)照品1 mg，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備成1 mg／mL 混合對(duì)照品溶液。在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩?、槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素峰面積RSD分 別 是 1.28%、1.02%、0.812%、1.69%、1.30%、1.69%、1.49%、0.707%。表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡酰奎寧酸、槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素峰面積RSD 分別是1.64%、1.07%、0.566%、1.98%、3.07%、2.88%、0.934%、0.854%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取雪菊2 號(hào)樣品6 份，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)得綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩帷㈤纹ぼ蘸捅韮翰杷胤迕娣eRSD 分別為0.51%、1.14%、0.41%、0.98%、2.06%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取0.25 g 雪菊樣品粉末3 份，置于50 mL 圓底燒瓶中，分別依次加入適量的綠原酸、木犀草苷、3，5?二咖啡?？鼘幩?、槲皮苷和表兒茶素對(duì)照品制備成供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝3）

2.5 不同產(chǎn)地樣品含有量分析 不同產(chǎn)地雪菊液相色譜指紋圖譜結(jié)果顯示，雪菊甲醇提取物所含化學(xué)成分具有一定的相似性，含有量差異較小，見(jiàn)圖2。綠原酸、木樨草苷和3，5?二咖啡酰奎寧酸作為雪菊中主要活性成分含有量較高，槲皮苷和表兒茶素含有量較低。實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到兒茶素、二氫楊梅素和楊梅素。雪菊2 號(hào)樣品中綠原酸和3，5?二咖啡?？鼘幩岬暮辛慷际亲罡叩?，分別達(dá)到4.39、3.89 mg／g；槲皮苷含有量最高達(dá)到1.09 mg／g。雪菊5 號(hào)中表兒茶素含有量最高為1.01 mg／g。雪菊1 號(hào)中木樨草苷含有量最高為29.68 mg／g。見(jiàn)表3。

圖2 5 批不同產(chǎn)地雪菊樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of five batches of S.proc?umbens from different growing areas

表3 雪菊中各成分含有量測(cè)定結(jié)果（，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents in S.procumbens （，mg／g）

注：—為未檢測(cè)出。

2.6 成分分析與比較 雪菊與商品菊花中所含主要化學(xué)成分差異較大。4 種商品菊花甲醇提取物中大多數(shù)物質(zhì)在25～40 min （20%～25% 乙腈）時(shí)洗脫出峰，但雪菊1 號(hào)甲醇提取物主要成分出現(xiàn)在20～25 min （15%～20% 乙腈），見(jiàn)圖3。綠原酸、木樨草苷、槲皮苷和3，5?二咖啡?？鼘幩崾茄┚蘸蜕唐肪栈ǖ墓灿蟹?。杭白菊、貢菊、黃金菊和胎菊的共有峰為綠原酸、木樨草苷、槲皮苷、3，5?二咖啡?？鼘幩岷投錀蠲匪?，其中楊梅素僅在胎菊和黃金菊中檢測(cè)到。在4 種商品菊花中未檢測(cè)出兒茶素和表兒茶素。表4 表明，貢菊中綠原酸和3，5?二咖啡酰奎寧酸含有量最高，分別達(dá)3.98、13.46 mg／g。其中，3，5?二咖啡?？鼘幩岬暮辛吭谒芯栈悠分凶罡?。木樨草苷在黃金菊中的含有量最高達(dá)2.75 mg／g，但低于5 個(gè)產(chǎn)地雪菊。二氫楊梅素的含有量在4種商品菊花中普遍較低，在黃金菊中含有量最高僅為0.066 mg／g。槲皮素在4 種商品菊花中的含有量都高于昆侖雪菊，其中在貢菊中的含有量最高達(dá)到3.63 mg／g。楊梅素在商品菊花中含有量較低，僅在黃金菊和胎菊中檢測(cè)到。

圖3 5 批不同種類樣品HPLC 指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of five different kinds of samples

表4 4 種商品菊花中各成分含有量測(cè)定結(jié)果（，mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in four commercial chrysanthemums （，mg／g）

表4 4 種商品菊花中各成分含有量測(cè)定結(jié)果（，mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in four commercial chrysanthemums （，mg／g）

注：—為未檢測(cè)出。

3 討論

3.1 色譜條件影響 2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定綠原酸、木樨草苷和3，5?二咖啡?？鼘幩岬臋z測(cè)采用乙腈?0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相［5］。由于磷酸添加劑易堵塞色譜柱，本實(shí)驗(yàn)以0.1%甲酸水溶液替代同樣能得到較好的峰形。檢測(cè)波長(zhǎng)是影響物質(zhì)檢測(cè)靈敏度和最低檢測(cè)限的重要指標(biāo)。為在單一波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定上述8 種成分的含有量，需要先考察每種成分的最大紫外吸收波長(zhǎng)。綠原酸和3，5?二咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸A） 兩種酚酸類的最大吸收波長(zhǎng)為328 nm［6］；兒茶素和表兒茶素屬于黃烷三醇類，其最大吸收波長(zhǎng)為 203.4、278.8 nm［7］。李向陽(yáng)等［8］對(duì)金銀花中木樨草苷及綠原酸等6 種成分進(jìn)行測(cè)定，木樨草苷最大吸收波長(zhǎng)為348 nm，綠原酸最大吸收波長(zhǎng)為327 nm，異綠原酸A 最大吸收波長(zhǎng)為329 nm。楊梅素屬于黃酮醇類，二氫楊梅素屬于二氫黃酮類。由于黃酮醇B 環(huán)C2?C3 位雙鍵的存在，使得楊梅素和二氫楊梅素呈現(xiàn)2 種不同的紫外吸收特征。陳圖峰等［9］對(duì)藤茶中二氫楊梅素和楊梅素含有量進(jìn)行測(cè)定，得到二氫楊梅素的最大吸收峰為205、290 nm，楊梅素的最大吸收峰為208、373 nm。槲皮苷是一種黃酮醇糖苷，其最大吸收波長(zhǎng)為256 nm［10］。綜合幾類成分共有紫外吸收波長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)最終選擇280 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 不同產(chǎn)地雪菊主要成分比較 不同產(chǎn)地的雪菊化學(xué)組成相近，但含有量各不相同，可能與海拔和采收期有關(guān)。孫自增等［11］研究雪菊中主要化學(xué)成分的分布特征，運(yùn)用主成分分析和聚類分析成功將昆侖山脈地區(qū)和天山山脈生長(zhǎng)的雪菊分成兩大類［12］。郭玉婷等［13］對(duì)和田地區(qū)5 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)生長(zhǎng)的雪菊中黃酮、皂苷、多糖和氨基酸含有量進(jìn)行分析，皮山縣克里陽(yáng)鄉(xiāng)所產(chǎn)雪菊中黃酮類成分含有量都較高，品質(zhì)較好，其次是策勒縣博斯坦鄉(xiāng)。雪菊品質(zhì)與產(chǎn)地海拔高度有著直接的關(guān)系，原因是海拔越高，氣溫越低，雪菊生長(zhǎng)周期將延長(zhǎng)，使得活性成分積累越多，品質(zhì)越好。本實(shí)驗(yàn)的5 個(gè)雪菊采集地中克里陽(yáng)鄉(xiāng)海拔最高，其次是博斯坦鄉(xiāng)、康克鄉(xiāng)、策勒鎮(zhèn)和芒來(lái)鄉(xiāng)?？死镪?yáng)鄉(xiāng)雪菊中綠原酸、3，5?二咖啡?？鼘幩岷烷纹ぼ盏暮辛慷际亲罡叩?，其次是博斯坦鄉(xiāng)。這些結(jié)果進(jìn)一步地揭示雪菊的質(zhì)量與其生長(zhǎng)海拔高度有直接關(guān)系。

3.3 雪菊與幾種商品菊花成分分析與比較 雪菊與杭白菊、貢菊、黃金菊和胎菊是同科不同屬植物，在黃酮類化合物組成和含有量上有明顯地差異。鄭大成等［14］采用薄層色譜法和定性分析法研究昆侖雪菊水溶性黃酮的組成，主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、查耳酮及異黃酮類。王亮等［4］分析并比較昆侖雪菊與杭菊、貢菊中主要活性成分含有量，發(fā)現(xiàn)綠原酸、木樨草苷和槲皮苷含有量在雪菊中都是最高的。本實(shí)驗(yàn)中，不同采集地雪菊中綠原酸含有量普遍高于4 種商品菊花，木樨草苷含有量是4 種商品菊花的10 余倍，但槲皮苷含有量都較低。李素云等［15］檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程中槲皮素、槲皮苷及其甲基化產(chǎn)物的存在形態(tài)，指出槲皮素及其衍生物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定致其極易氧化降解，因此雪菊材料采摘后應(yīng)干燥、密封保存。值得注意的是，表兒茶素僅在雪菊中被檢測(cè)到，未在4 種商品菊花中檢測(cè)到。表兒茶素作為原花色素合成的前體，后期聚合形成縮合單寧，在多酚氧化酶的催化下進(jìn)一步地氧化成有色醌類［16］，這可能與雪菊呈現(xiàn)深棕褐色有關(guān)。二氫楊梅素在黃酮醇合成酶的催化下合成楊梅素，是無(wú)色花青素合成的前體［17］。本實(shí)驗(yàn)在貢菊、杭白菊、胎菊和黃金菊中都檢測(cè)到二氫楊梅素，在胎菊和黃金菊中檢測(cè)到楊梅素，但都未檢測(cè)出表兒茶素，可能是積累在胎菊和黃金菊中的楊梅素合成的黃烷三醇類較少，因此其花色相對(duì)雪菊更淺。