蘭繼平 張潔玉 童仁超李 娜李 緯李亞娟王崢濤楊 莉*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所， 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院， 上海201203）

高血壓（Hypertension） 是最常見的心血管疾病之一，它是以體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為主要表現(xiàn)，可伴有心、腦、腎等器官功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征，可導(dǎo)致腦卒中、冠心病等，在臨床上有高致殘率和高致死率的特點(diǎn)［1?2］。隨著社會(huì)工作頻率和生活節(jié)奏的加快，高血壓的發(fā)病率已在逐年上升。據(jù)報(bào)道，目前我國(guó)18 歲及以上成人高血壓患病率為25.2%［3］。目前臨床上用于治療高血壓的藥物有很多種，但都存在著局限性，長(zhǎng)期服藥甚至有著明顯的不良反應(yīng)［4］。而中藥因其成分的多樣性而具有的多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)在治療高血壓方面受到越來(lái)越多人的關(guān)注［5］。

車前子為車前科車前屬植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥成熟種子，有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰等功效?，F(xiàn)代研究表明車前子具有治療高血壓、糖尿病和機(jī)體脂質(zhì)紊亂的作用［6］。本實(shí)驗(yàn)以車前子為研究對(duì)象，以原發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneous Hy?pertension Rat，SHR） 為模型，探討車前子對(duì)SHR高血壓的作用，通過對(duì)腎素?血管緊張素?醛固酮系統(tǒng)（Renin?Angiotensin?Aldosterone System，RAAS）和血管相關(guān)功能的研究，探討其可能的降血壓途徑。

1 材料

1.1 藥物與試劑 車前子藥材 （批號(hào)1212030642，產(chǎn)地江西） 購(gòu)自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥所吳立宏副研究員鑒定為正品。福辛普利鈉片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20023371）購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)；氯化鎂（批號(hào)20140821）、碳酸氫鈉（批號(hào)201401201）、氯化鈣 （批號(hào) 201201025）、葡萄糖 （批號(hào)20160322）、95%乙醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；水為自制蒸餾水。苯腎上腺素（Phe?nylephrine，PE，批號(hào)P6126）、乙酰膽堿（Acetyl?choline，ACH，批號(hào)A6625）、硝普鈉（Sodium ni?troprusside，SNP，批號(hào) SN?60Q91） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。腎素（Renin，批號(hào)EL160617）、血管緊張素Ⅱ （Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ，批號(hào)EL161117）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin con?verting enzyme，ACE，批號(hào)EL170218）、醛固酮（Aldosterone，ALD，批號(hào)EL170618） 酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自廣州瑞博奧生物科技有限公司；內(nèi)皮素?1（Endothelin?1，ET?1，批號(hào)SBJ?R0140）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （Endothelial nitric oxide synthase，eNOS，批號(hào)SBJ?T0017） 酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 儀器 ALC?NIBP 大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；BH2 型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；ML740 型PowerLab／4SP 生物信號(hào)處理和分析系統(tǒng)（澳大利亞ADInstruments 公司）；恒溫平滑肌浴槽為上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所自制；744 型PH 計(jì)［瑞士Metrohm （萬(wàn)通） 公司］；RH?KT／C 型磁力攪拌器［廣州愛卡儀器設(shè)備（IKA） 公司］。

1.3 動(dòng)物 8～12 周齡清潔級(jí)雄性SHR 和Wistar?Kyoto （WKY） 大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2016?006，飼養(yǎng)于上海南方模式生物中心清潔級(jí)屏障動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)鼠籠，動(dòng)物進(jìn)食進(jìn)水不限，光照周期12 h／12 h，室溫22～23 ℃，相對(duì)濕度45%～50%。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

2 方法

2.1 藥物制備 取車前子適量，加入10 倍量95%乙醇，熱回流提取2 h，提取3 次，合并提取液，50 ℃減壓回收溶劑，冷凍干燥得到車前子干燥浸膏。4 ℃密封保存，臨用時(shí)取適量浸膏制成0.13 g 生藥／mL溶液。陽(yáng)性藥溶液，取福辛普利鈉片2 粒（含福辛普利鈉，10 mg／片），研碎，溶于40 mL 蒸餾水中，得到質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL 福辛普利鈉溶液。

2.2 配置Krebs?Henseleit （K?H） 溶液 在磁力攪拌器下，2 L 雙蒸水中依次加入氯化鈉13.792 g、氯化鉀0.701 g、氯化鈣0.566 g、硫酸鎂0.284 g、磷酸二氫鉀0.321 g、碳酸氫鈉4.180 g、葡萄糖4.399 g （為避免形成難溶物使溶液渾濁，應(yīng)在上1個(gè)化合物完全溶解后再加下1 個(gè)化合物），充分?jǐn)嚢枞芙夂螅孟←}酸調(diào)節(jié)pH 至7.40 左右，即得。

2.3 配置氯化鉀溶液 在磁力攪拌下，在1 L 水中分別加入氯化鈉36.64 g、氯化鉀44.73 g、磷酸二氫鉀1.632 g、碳酸氫鈉21.004 g、充分溶解得到高濃度氯化鉀母液。取高濃度氯化鉀母液50 mL，氯化鈣0.184 g，氯化鎂0.122 g，葡萄糖1.0 g，加入到450 mL 純水中充分溶解搖勻，調(diào)節(jié)pH 到7.4，即得。

2.4 分組 選用8～12 周齡雄性SHR 24 只和WKY 大鼠8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。利用大鼠無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量每只SHR 血壓，將SHR 隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥組（2.5 mg／kg）、車前子組（1.3 g 生藥／kg），WKY 大鼠作為正常組，每組8 只。各組大鼠按5 mL／kg 灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)8 周，其中正常組和模型組給予相同體積蒸餾水。每2 周采用ALC?NIBP 大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)定各組大鼠尾動(dòng)脈壓。動(dòng)物禁食不禁水8 h，腹腔注射20%烏拉坦麻醉（7 mL／kg），腹主動(dòng)脈收集血液，迅速分離主動(dòng)脈弓下約1 cm 處長(zhǎng)約1.2 cm 的胸主動(dòng)脈，置于K?H 液平皿中，待做后續(xù)處理。

2.5 動(dòng)脈血管環(huán)舒縮功能測(cè)定 大鼠離體動(dòng)脈血管環(huán)的制備，將置于4 ℃預(yù)冷、預(yù)氧飽和的K?H液中的動(dòng)脈條，在顯微鏡下小心清除血管表面多余組織后，每根動(dòng)脈剪約3 mm 長(zhǎng)的血管環(huán)2 根，將血管環(huán)置于盛有37 ℃恒溫K?H 液（4 mL） 中，并持續(xù)通入95%氧氣、5%二氧化碳的混合氣體的麥?zhǔn)显〔壑?，每個(gè)血管環(huán)用2 個(gè)L 型不銹鋼小鉤小心貫穿入血管環(huán)的腔管，一段固定在浴槽底端，另一端通過絲線連接張力換能器，張立的變化傳輸并計(jì)入在PowerLab／4SP 生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)。

動(dòng)脈血管環(huán)張力的測(cè)定，制備好的血管環(huán)固定在浴槽，給予2 g 張力（靜息張力） 并穩(wěn)定平衡60 min，每20 min 換1 次K?H 液。血管環(huán)張力穩(wěn)定之后，棄去K?H 液，加入已在37 ℃預(yù)熱的氯化鉀溶液，20 min 達(dá)到穩(wěn)定之后，記錄數(shù)據(jù)，棄去氯化鉀溶液，重新?lián)Q上37 ℃預(yù)熱的K?H 液，血管舒張達(dá)到穩(wěn)定之后再次換上37 ℃預(yù)熱的氯化鉀溶液，血管收縮達(dá)到穩(wěn)定之后計(jì)入數(shù)據(jù)，再次換上37 ℃預(yù)熱的K?H 液。穩(wěn)定之后，以累計(jì)濃度的PE （1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L） 作用于動(dòng)脈血管環(huán)上，每個(gè)濃度作用至平衡，大約時(shí)間為5 min，以最后1 次K?H 液的穩(wěn)定值為基準(zhǔn)值，記錄加入PE 穩(wěn)定時(shí)的數(shù)據(jù)。后棄去浴槽內(nèi)液體，用K?H 也重新平衡3 次，20 min／次。最后一次平衡之后，加入10-6mol／L 濃度的PE 刺激血管環(huán)，使血管收縮達(dá)到最大幅度，再先后給予累計(jì)濃度的ACH （1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L） 作用于動(dòng)脈血管環(huán)，引起血管舒張，每個(gè)濃度作用5 min。最后穩(wěn)定在最后1 個(gè)ACH 濃度時(shí)加入10 μL SNP，平衡時(shí)記錄數(shù)據(jù)。

以血管環(huán)在10-6mol／L 濃度PE 達(dá)到的最大收縮幅度和加入SNP 穩(wěn)定的舒張幅度之間的差值作為100%，將各濃度ACH 引起的舒張反應(yīng)與最大收縮幅度比較，計(jì)算出各自的舒張百分值，繪制量?效曲線。本實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中心實(shí)驗(yàn)室完成。

2.6 檢測(cè)生化指標(biāo) 按酶聯(lián)免疫試劑盒所述方法分別測(cè)定并計(jì)算血清中Renin、ALD、ACE、AngⅡ、eNOS 和ET?1 的水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較比較采用t檢驗(yàn)。以P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 車前子對(duì)SHR 血壓的影響 如表1 所示，除正常組外，模型組和各給藥組大鼠在給藥前血壓均大于160 mmHg；給藥2 周后，模型組血壓上升至（184.59±3.16） mmHg，與模型組比較，車前子組血壓下降（P＜0.001）；連續(xù)給藥8 周后，車前子組與模型組（187.83±1.15） mmHg 相比下降幅度達(dá)到20 mmHg 左右（P＜0.01）。提示長(zhǎng)期服用車前子可維持收縮壓在較低的水平。

表1 各組給藥8 周大鼠收縮壓（mmHg，1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）Tab.1 Systolic blood pressure of rats in each group after 8 weeks of administration in SHR （mmHg，1 mmHg ＝0.133 kPa，， n＝8）

表1 各組給藥8 周大鼠收縮壓（mmHg，1 mmHg＝0.133 kPa，， n＝8）Tab.1 Systolic blood pressure of rats in each group after 8 weeks of administration in SHR （mmHg，1 mmHg ＝0.133 kPa，， n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 血清中RAAS 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 如圖1 所示，與正常組比較，模型組中調(diào)控血壓升高相關(guān)指標(biāo)ALD、Renin、ACE、Ang Ⅱ水平增加（P＜0.01）。給藥8 周后，與模型組比較，車前子組中大鼠血清ALD、Renin、ACE、Ang Ⅱ水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。表明車前子可通過調(diào)控RAAS 的紊亂，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控血壓的目的。

圖1 各組大鼠RAAS 的水平（n＝8）Fig.1 Levels of RAAS in each group （n＝8）

3.3 PE 作用于胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮率 SHR 胸主動(dòng)脈血管環(huán)收縮率比較，模型組收縮率在PE 濃度為1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol／L 時(shí)與正常組比較分別增強(qiáng)了438.0%、68.4%、32.6%和33.0%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表明模型組SHR 的胸主動(dòng)脈的收縮明顯增強(qiáng)。與模型組比較，車前子組在PE 濃度為1×10-6、1×10-5mol／L 收縮率分別減小了17.8%、18.1% （P＜0.01），表明車前子對(duì)這幾個(gè)濃度PE引起的血管收縮上有抑制作用（P＜0.01）。結(jié)果見表2、圖2。

表2 各組大鼠在不同PE 濃度下的血管環(huán)收縮率（%，， n＝8）Tab.2 Vascular ring contraction rate of rats in each group at different PE concentrations （%，， n＝8）

表2 各組大鼠在不同PE 濃度下的血管環(huán)收縮率（%，， n＝8）Tab.2 Vascular ring contraction rate of rats in each group at different PE concentrations （%，， n＝8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

圖2 各組大鼠在不同PE 濃度下的血管環(huán)收縮率曲線（n＝8）Fig.2 Vascular ring contraction rate curves of rats in each group at different PE concen?trations （n＝8）

3.4 ACH 作用于胸主動(dòng)脈血管環(huán)舒張率 與正常組比較，模型組胸主動(dòng)脈血管環(huán)在1×10-8～1×10-5mol／L ACH 作用下，舒張率下降 （P＜0.05，P＜0.01），表明高血壓大鼠血管的舒張受到明顯的抑制。給藥之后，與模型組比較，車前子組胸主動(dòng)脈血管環(huán)在1×10-8、1×10-7、1×10-6mol／L ACH 作用下舒張率升高（P＜0.05），表明車前子能顯著性的改善ACH 誘導(dǎo)的高血壓大鼠血管舒張受抑制的情況。結(jié)果見表3、圖3。

3.5 血清中eNOS 和ET?1 水平的測(cè)定 如圖4 所示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠中eNOS 和ET?1 的水平分別上升了17.1%、24.0%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給藥后，與模型組相比，車前子組中模型大鼠血清中的eNOS、ET?1 水平分別降低了11.1%、30.5%，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明車前子可抑制SHR 中高表達(dá)eNOS、ET?1 水平，這可能是車前子能降低血壓的途徑之一。

表3 各組大鼠在不同ACH 濃度下的血管環(huán)舒張率（%，， n＝8）Tab.3 Vascular ring relaxation rate in each group at different ACH concentrations （%，， n＝8）

表3 各組大鼠在不同ACH 濃度下的血管環(huán)舒張率（%，， n＝8）Tab.3 Vascular ring relaxation rate in each group at different ACH concentrations （%，， n＝8）

注：與正常組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖3 各組大鼠在不同ACH 濃度下的血管環(huán)舒張率曲線（n＝8）Fig.3 Vascular ring relaxation rate curves of rats in each group at different ACH concentrations （n＝8）

4 討論

圖4 給藥后各組大鼠內(nèi)皮相關(guān)功能指標(biāo)水平（n＝8）Fig.4 Levels of endothelial?related function indexes after administration （n＝8）

RAAS 不僅在心血管系統(tǒng)的發(fā)育、血壓和血容量的調(diào)節(jié)、以及心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的重塑方面起著重要作用，還與水鹽代謝有著密切的聯(lián)系，在人類高血壓形成中起著至關(guān)重要的作用［7］。腎素是由腎小球細(xì)胞合成和分泌的一種酸性蛋白酶，通過腎靜脈進(jìn)入血液循環(huán)后，刺激使血中由肝生成的血管緊張素原（屬α 球蛋白） 產(chǎn)生血管緊張素Ⅰ（AngI，10 肽），而Ang 在ACE 作用下變成AngⅡ（10 肽）［8］。AngⅡ是已知最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)之一，可作用于血管平滑肌，使全身微動(dòng)脈收縮，動(dòng)脈血壓增高，另外AngⅡ促進(jìn)ALD 的分泌，激活RAAS，引起血壓升高［9］。AngⅡ不僅具有調(diào)節(jié)血管的收縮作用，并且和氧化應(yīng)激和炎癥因子息息相關(guān)［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，車前子能顯著降低SHR Renin、ACE、AngⅡ和ALD 的水平，從而達(dá)到降壓的目的。

血管腔的大小由血管平滑肌的收縮狀態(tài)決定，所以血管平滑肌的緊張程度異常增大參與了血管性疾病的發(fā)生機(jī)制［11］。其中Ca2＋和血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一系列，如NO、前列腺素、超極化因子，作為關(guān)鍵性因子影響著血管平滑肌的舒縮。其中Ca2＋的影響主要源于它的內(nèi)流和外流。Ca2＋的內(nèi)流主要通過平滑肌細(xì)胞的電壓依賴性Ca2＋通道和受體操縱性Ca2＋通道來(lái)完成的［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予藥物車前子之后，胸主動(dòng)脈在PE 的刺激下的收縮明顯得到了抑制，在ACH 的刺激下的舒張有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)果表明車前子對(duì)于高血壓大鼠的血管舒縮功能有著改善作用，這可能是車前子降血壓作用的重要途徑之一。

另外，血管內(nèi)皮功能障礙在高血壓的發(fā)病及其所致的慢性并發(fā)癥中起重要作用。NO 和ET?1 之間復(fù)雜的相互作用可以促使血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生。ET?1 與血壓水平呈正相關(guān)外，與靶器官損害程度呈平行關(guān)系，因此，ET?1 在高血壓病及其并發(fā)癥的診斷和療效判定上有重大的意義。NO 是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的具有可擴(kuò)散性、擴(kuò)張血管的一種物質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO 在生理狀態(tài)下可使內(nèi)皮下血管平滑肌細(xì)胞處于增殖靜止?fàn)顟B(tài)從而達(dá)到抗血管壁增殖的作用［13?14］，因此對(duì)于血壓的調(diào)控同樣起著重要的作用。而給予藥物車前子之后，模型大鼠中ET?1 和eNOS 的水平顯著降低，表明調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能亦是車前子降血壓的重要途徑之一。

綜上所述，車前子對(duì)SHR 有著良好的降低血壓作用，其對(duì)SHR RAAS 中紊亂Renin、ACE、AngⅡ、ALD 水平，血管舒張和收縮功能障礙以及血管內(nèi)皮相關(guān)功能ET?1 和eNOS 紊亂的改善作用可能是降低血壓的重要途徑。