唐保露 鄭宇辰 張葉明 袁 萍 戚小宇 張 旭 楊解人 鄭書(shū)國(guó)

（1.皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 安徽蕪湖241002； 2.皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院， 安徽蕪湖241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 安徽蕪湖241002； 4.皖南醫(yī)學(xué)院定量藥理研究所， 安徽蕪湖241002）

2 型糖尿病是一種以胰島素抵抗、高血糖和胰島β 細(xì)胞功能障礙為特征的代謝性疾病，其病因復(fù)雜，其中肥胖是最主要危險(xiǎn)因素之一［1］。大多數(shù)肥胖人群血漿游離脂肪酸水平明顯升高，高水平脂肪酸對(duì)胰島β 細(xì)胞可產(chǎn)生明顯毒性作用，并可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗［2］。短期暴露于高濃度游離脂肪酸，可使胰島素分泌代償性增加，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能損傷，甚至發(fā)生凋亡［3］。胰島β 細(xì)胞數(shù)量減少及功能損傷是發(fā)生糖尿病的主要機(jī)制之一［4］。因此抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島功能損傷和β 細(xì)胞凋亡是防治2 型糖尿病的重要措施之一。

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴” 范疇，其發(fā)生發(fā)展與脾胃關(guān)系密切，其中脾氣虧虛是糖尿病發(fā)病的重要病機(jī)，“脾虛致消” “健脾愈消” 已成為中醫(yī)治療糖尿病的重要理論依據(jù)之一，臨床以益氣健脾方治療2 型糖尿病也取得較好療效［5?6］。四君子湯是益氣健脾的經(jīng)典方劑，由黨參、白術(shù)、茯苓和甘草組成，臨床用于治療糖尿病取得了良好的效果［7］，但對(duì)其改善2 型糖尿病的確切機(jī)制，目前仍不清楚。前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，四君子顆粒可明顯改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠糖尿病前期狀態(tài)，減少胰島細(xì)胞凋亡。本研究采用體外培養(yǎng)的小鼠胰島β 細(xì)胞株（MIN6 細(xì)胞），應(yīng)用血清藥理學(xué)方法觀察四君子湯對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞損傷和凋亡的影響，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度探究其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 30 只SD 大鼠購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （浙） 2014?0001。

1.2 藥物與試劑 四君子顆粒（李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)20180516）；MIN6 細(xì)胞株（上海博古生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)AD12854263）、胎牛血清（批號(hào)MKF0602） 購(gòu)自美國(guó) HyClone 公 司；棕 櫚 酸 鈉 （批 號(hào)SLBQ0242V）、β?巰基乙醇（批號(hào)STBJ3747） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （貨號(hào)BB18061）、細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)BB18061X） 購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；葡 萄 糖 調(diào) 節(jié) 蛋 白?78 （GRP78，批 號(hào)120617180313）、ATF4 抗體（批號(hào)011018180606）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PERK （批號(hào)66r8853）、p?PERK 抗體（批號(hào)86w3361） 購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司；CHOP 抗體 （批號(hào)57c6807） 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；β?actin 抗體（批號(hào)20180926） 購(gòu)自博士德生物工程有限公司；ECL 發(fā)光試劑盒（批號(hào)20180822）購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)SIM 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；DYY?6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Mini PROTEAN 轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio?Rad 公司）；Fluor chem FC3 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple 公司）；Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Millipore 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 30 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組及四君子顆粒高、低劑量組 （10.5、5.25 g／kg），每組10 只，除正常對(duì)照組，其余2組分別灌胃給予高、低劑量四君子顆粒（10.5、5.25 g／kg），連續(xù)給藥7 d。末次給藥2 h 后，戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，無(wú)菌條件下分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MIN6 細(xì)胞培養(yǎng) 將MIN6 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中（含50 μmol／L β?巰基乙醇），置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合時(shí)，用0.25% 胰酶消化后傳代培養(yǎng)。

2.3 MIN6 細(xì)胞活力檢測(cè) 將MIN6 細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，以2×104／孔接種于96 孔培養(yǎng)板，24 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌后加入新的培養(yǎng)液，細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、空白血清組及四君子顆粒高、低劑量組。四君子顆粒高、低劑量組分別加入相應(yīng)的含藥血清，空白血清組加入空白對(duì)照組血清，使血清終濃度為10%，孵育 24 h；除對(duì)照組外，其余各組更換含0.4 mmol／L的棕櫚酸培養(yǎng)基，孵育24 h，CCK?8 法檢測(cè)細(xì)胞活性。

2.4 MIN6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MIN6 細(xì)胞，0.25% 胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，接種于6 孔培養(yǎng)板，24 h 后更換新鮮培養(yǎng)液。按“2.3” 項(xiàng)下分組及藥物處理。棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌后0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌2次。用400 μL Annexin V 結(jié)合液懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V?FITC 染色液，輕輕混勻后于4 ℃避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）。

2.5 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，按“2.3” 項(xiàng)下分組及藥物處理。棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，加入0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PIPA 裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制劑） 冰浴裂解細(xì)胞。12 000g離心15 min，收集上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入β?actin、GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK、PERK 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL發(fā)光液顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析條帶光密度，結(jié)果以 GPR78／β?actin、ATF4／β?actin、CHOP／β?actin、P?PERK／PERK 表示。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用DAS1.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 四君子顆粒對(duì)MIN6 細(xì)胞活力的影響 由圖1可見(jiàn)，0.4 mmol／L 棕櫚酸孵育MIN6 細(xì)胞24 h 后可以誘導(dǎo)MIN 6 細(xì)胞損傷（P＜0.01）；四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h 可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，空白血清組MIN 6 細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示四君子顆?？捎行Ц纳谱貦八嵴T導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

圖1 四君子顆粒對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞損傷的影響（， n＝6）Fig.1 Effects of SGs on the viability of palmitic acid?induced MIN6 cells （， n＝6）

3.2 四君子顆粒對(duì)MIN6 細(xì)胞凋亡的影響 正常培養(yǎng)條件下，MIN6 細(xì)胞凋亡率很低，0.4 mmol／L棕櫚酸誘導(dǎo)24 h 后，MIN6 細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01），表現(xiàn)為凋亡早期和凋亡晚期的細(xì)胞均增加；四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h 可降低棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞凋亡（P＜0.01），而空白對(duì)照血清對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖2。提示四君子顆?？捎行б肿貦八嵴T導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞凋亡。

3.3 四君子顆粒對(duì)MIN6 細(xì)胞GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 表達(dá)的影響 由圖3 可知，正常培養(yǎng)條件下，MIN6 細(xì)胞GRP78、ATF4 及CHOP蛋白表達(dá)較低，PERK 蛋白磷酸化也較低；0.4 mmol／L 棕櫚酸誘導(dǎo)24 h 后，MIN6 細(xì)胞GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h 可降低細(xì)胞內(nèi)GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），而空白對(duì)照血清對(duì)GRP78、ATF4、CHOP 及p?PERK 蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響，提示四君子顆粒含藥血清可明顯減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這一作用與其抑制細(xì)胞凋亡作用一致，四君子顆粒抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK? ATF4?CHOP 信號(hào)通路有關(guān)。

圖2 四君子顆粒對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞凋亡的影響（， n＝4）Fig.2 Effects of SGs on the apoptosis of palmitic acid?induced MIN6 cells （， n＝4）

4 討論

流行病學(xué)資料顯示，肥胖是2 型糖尿病最主要危險(xiǎn)因素之一，糖尿病患者除表現(xiàn)為高血糖外，還普遍存在脂代謝紊亂，表現(xiàn)為血漿三酰甘油（TG）、極低密度脂蛋白（VLDL） 和游離脂肪酸等水平顯著升高［9］。大量研究顯示，高水平游離脂肪酸一方面可干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起胰島素抵抗，另一方面可誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島功能受損，誘發(fā)2 型糖尿病。因此，抑制高濃度游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞損傷和胰島素抵抗是防治肥胖相關(guān)2 型糖尿病的有效途徑之一。本研究采用血清藥理學(xué)方法，觀察四君子顆粒對(duì)MIN6 小鼠胰島 β 細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，0.4 mmol／L 棕櫚酸孵育24 h 后，MIN6 細(xì)胞活力明顯受損，細(xì)胞凋亡明顯升高，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］。四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h，棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞凋亡也顯著下降，而空白對(duì)照血清對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和凋亡無(wú)明顯影響，提示四君子顆粒含藥血清可有效改善棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞損傷和凋亡。

圖3 四君子顆粒對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞GRP78、ATF4、CHOP、p?PERK 表達(dá)的影響（， n＝4）Fig.3 Effects of SGs on GRP78，ATF4，CHOP and p?PERK expression of palmitic acid?induced MIN6 cells （，n＝4）

游離脂肪酸可刺激胰島β 細(xì)胞合成與分泌胰島素，而長(zhǎng)期暴露于高濃度游離脂肪酸則會(huì)加重β細(xì)胞胰島素分泌負(fù)荷［11］。當(dāng)胰島素合成大量增加時(shí)，作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成與翻譯后加工重要場(chǎng)所的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)加重，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［12］。一旦發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞首先啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein re?sponse，UPR） 以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。GRP78 合成增加是UPR 標(biāo)志性事件之一［13］。本研究結(jié)果顯示，暴露于棕櫚酸24 h 后，MIN6 細(xì)胞GRP78 蛋白表達(dá)顯著升高，說(shuō)明棕櫚酸誘發(fā)了明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。四君子顆粒含藥血清預(yù)孵24 h后可明顯下調(diào)細(xì)胞內(nèi)GRP78 蛋白表達(dá)，而空白對(duì)照血清對(duì)GRP78 表達(dá)無(wú)明顯影響，提示四君子顆粒含藥血清可有效改善棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

生理?xiàng)l件下，GRP78 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白肌醇需求酶 1α （inositol?requiring enzyme 1α，IRE1α）、活化轉(zhuǎn)錄因子6 （activating transcription factor 6，ATF6） 和RNA?依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PRK like ER associated kinase，PERK） 結(jié)合而使后者處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚時(shí)，一方面細(xì)胞代償性合成GRP78增加；另一方面，結(jié)合于3 種膜蛋白上的GRP78解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合未折疊蛋白，游離出的IRE?1α、PERK、ATF6 進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游信號(hào)傳遞及相關(guān)基因表達(dá)［13］。通過(guò)上述信號(hào)通路，UPR 可改變細(xì)胞代謝方式，促使細(xì)胞存活。但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)于強(qiáng)烈或持續(xù)時(shí)間過(guò)久，UPR 無(wú)法使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)時(shí)，則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。IRE?1α、PERK和ATF6 通路的活化均可上調(diào)CHOP 蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中PERK 途徑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮主要作用［14］。本研究結(jié)果顯示，與棕櫚酸孵育24 h 后，MIN6 細(xì)胞內(nèi)ATF4 蛋白、磷酸化PERK 及其下游蛋白CHOP 表達(dá)均顯著升高，而與四君子顆粒含藥血清預(yù)孵可明顯抑制上述蛋白表達(dá)，這一作用與四君子顆粒含藥血清抑制MIN6細(xì)胞凋亡作用一致，提示四君子顆粒含藥血清抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞凋亡與抑制細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK 相關(guān)凋亡信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，四君子顆粒含藥血清可有效抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK 信號(hào)通路有關(guān)。該研究結(jié)果提示，四君子顆粒防治2 型糖尿病可能與保護(hù)胰島β 細(xì)胞、改善胰島功能有關(guān)。