周 和 譚翔勻 馮 華 王 奧

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院， 貴州遵義563002）

通絡(luò)止痛膠囊由虎杖、當歸、獨活、威靈仙、全蝎、蘄蛇、杜仲等16 味藥材組成，方中虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛；當歸補血活血、調(diào)經(jīng)止痛；獨活祛風(fēng)除濕、通痹止痛，配合其他藥材可充分發(fā)揮該制劑搜風(fēng)通絡(luò)、活血止痛、祛風(fēng)除濕的功效，主要用于骨痹、風(fēng)濕痹血瘀阻絡(luò)癥所致肌肉麻木及關(guān)節(jié)、腰頸疼痛等癥［1］。但該制劑藥味多，成分復(fù)雜，傳統(tǒng)的單一成分測定難以全面控制其質(zhì)量，而且存在費時費力、成本高昂的缺點，以及對照品質(zhì)量不穩(wěn)定、供應(yīng)不充足等因素的制約。

近年來，一測多評法越來越受到重視，在2015 年版《中國藥典》 編制大綱一部綱要中，國家藥典委員會也重點提出要引入該方法［2］，它在僅使用1 種對照品的情況下，利用相對校正因子來同時測定其他成分的含有量，具有經(jīng)濟、高效、制約因素少的優(yōu)勢，已成功應(yīng)用于清熱止咳顆粒、細辛、新疆軟紫草、羅布麻葉等多種中藥材及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制［3?10］。另外，指紋圖譜可反映整體化學(xué)成分信息，而一測多評法可用于定量，兩者聯(lián)合應(yīng)用能更科學(xué)地評價中藥及其復(fù)方制劑的整體質(zhì)量［11?17］。因此，本實驗建立一測多評法［18］同時測定通絡(luò)止痛膠囊中虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的含有量，并結(jié)合HPLC 指紋圖譜來反映該制劑整體化學(xué)成分信息，可為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC?1260 型高效液相色譜儀（美國Ag?ilent 公司）；AB204?S 型電子天平（北京中恒日鑫科技有限公司）；KQ?500DV 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為11575?200502、111773?201614、110822?201710、111583?201605）。通絡(luò)止痛膠囊（批號161201、161202、161203 購于遵義市中醫(yī)院，批號19091601、19091602、19091603、19092301、19092302、19092303、19092304，自制）。甲醇、磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XSelect C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A） ?0.5% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，80%～60% B；15～25 min，60%～50% B；25～35 min，50% B；35～45 min，50%～30%B；45～60 min，30%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成分別含虎杖苷0.830 4 mg／mL、阿魏酸0.053 6 mg／mL、蛇床子素0.782 9 mg／mL、二氫歐山芹醇當歸酸酯1.245 5 mg／mL 的貯備液，精密吸取0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，置于5 個10 mL 量瓶中，甲醇稀釋，即得。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊內(nèi)容物適量，研細，取約3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入30 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，靜置至室溫，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例制備缺獨活（含蛇床子素、二氫歐山芹醇）、缺虎杖（含虎杖苷）、缺當歸 （含阿魏酸） 的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰達到基線分離，理論塔板數(shù)均大于5 000，與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，陰性無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣10 μL 測定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，分別以信噪比（S／N） 3、10 計算檢測限、定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液（批號161201），在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.39%、1.04%、0.30%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取膠囊（批號161201） 內(nèi)容物適量，按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.45%、1.70%、0.57%、0.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號161201），于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.93%、1.86%、1.35%、1.62%，表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含有量已知的膠囊9 份，每份1.50 g，每3 份1 組，精密加入80%、100%、120% 水平對照品溶液，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.3.7 相對校正因子計算 取“2.2.1” 項下對照品溶液，在 “2.1” 項色譜條件下進樣2、5、10、12、15、20 μL 測定，以虎杖苷為內(nèi)標，計算其他3 種成分的相對校正因子，結(jié)果見表3。

2.4 耐用性考察

2.4.1 儀器、色譜柱 本實驗考察了Agilent 1260、Waters 2695 色譜儀，以及XSelect C18、Eclipse C18、Diamonsil C18色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2.50%）。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.2 檢測波長 本實驗考察了檢測波長332、330、328 nm 對相對校正因子的影響。結(jié)果，阿魏酸相對校正因子分別為0.552、0.553、0.556，RSD 為0.38%；蛇床子素相對校正因子分別為0.835、0.832、0.835，RSD 為0.21%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.153、1.146、1.151，RSD 為0.31%，可知均無明顯影響。

2.4.3 體積流量 本實驗考察了體積流量0.8、1.0、1.2 mL／min 對相對校正因子的影響。結(jié)果，阿魏酸相對校正因子分別為 0.558、0.553、0.568，RSD 為1.36%；蛇床子素相對校正因子分別為0.837、0.832、0.825，RSD 為0.73%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.159、1.146、1.165，RSD 為0.84%，可知均無明顯影響。

2.4.4 柱溫 本實驗考察了柱溫20、25、30 ℃對相對校正因子的影響。結(jié)果，阿魏酸相對校正因子分別為0.547、0.553、0.560，RSD 為1.18%；蛇床子素相對校正因子分別為 0.821、0.832、0.835，RSD 為0.89%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.158、1.146、1.132，RSD 為1.14%，可知均無明顯影響。

2.4.5 磷酸體積分數(shù) 本實驗考察了磷酸體積分數(shù)0.4%、0.5%、0.6% 對相對校正因子的影響。結(jié)果，阿魏酸相對校正因子分別為0.537、0.553、0.562，RSD 為2.30%；蛇床子素相對校正因子分別為0.861、0.832、0.839，RSD 為1.79%；二氫歐山芹醇當歸酸酯相對校正因子分別為1.105、1.146、1.143，RSD 為2.02%，可知均無明顯影響。

2.5 色譜峰定位 精密吸取對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表5。由此可知，不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響較小，RSD 均小于5%，表明相對保留時間法可用于定位色譜峰。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝9）

表3 各成分相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6 樣品含有量測定 取10 批膠囊，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表6，可知2 種方法所得結(jié)果接近，差異百分比 （PD） 均小于2%。

表5 各成分相對保留時間Tab.5 Relative retention time of various constituents

2.7 HPLC 指紋圖譜建立

2.7.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S1，批號161201），在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 為0.15%～0.46%，相對峰面積RSD 為0.12%～0.97%，所采集指紋圖譜的相似度均大于0.97，表明儀器精密度良好。

表6 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents （mg／g）

2.7.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（S1），于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.1” 項下色譜條件進樣測定，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于1.72%，指紋圖譜相似度均大于0.96，表明溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗 取樣品（S1），平行制備6份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.59%，相對峰面積RSD 均小于1.43%，指紋圖譜相似度均大于0.96，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 指紋圖譜生成及相似度評價 取10 批膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版），選擇樣品S1 圖譜作為對照指紋圖譜，通過多點校正全譜匹配后確定21 個共有峰，生成指紋圖譜共有模式，見圖2。另外，10 批樣品相似度分別為0.984、0.996、0.973、0.980、0.982、0.962、0.971、0.978、0.985、0.987，均大于0.95，表明不同批次樣品之間的差異較小，穩(wěn)定性良好。

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for ten batches of samples

2.7.5 共有峰 21 個共有峰的峰面積總和占色譜峰總面積的93.51%，表明它代表性較好，然后在供試品溶液中加入對照品溶液以考察相應(yīng)共有峰是否增高，同時與對照品溶液圖譜進行比較（圖1），確定6 號峰為虎杖苷，7 號峰為阿魏酸，20 號峰為蛇床子素，21 號峰為二氫歐山芹醇當歸酸酯，并選擇峰形好、位置適中、前后無色譜峰干擾的虎杖苷作為參照峰（S 峰）。再計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD，結(jié)果見表7～8，可知它們均小于2.0%，表明指紋圖譜穩(wěn)定性良好。

表7 共有峰相對保留時間Tab.7 Relative retention time of common peaks

表8 共有峰相對峰面積Tab.8 Relative peak areas of common peaks

3 討論

3.1 指標成分、內(nèi)標選擇 根據(jù)通絡(luò)止痛膠囊中16 味藥材的主要成分及其藥理作用，本實驗考察了虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、毛蕊花糖苷、蒿本內(nèi)酯、松脂醇二葡萄糖苷。其中，毛蕊花糖苷、蒿本內(nèi)酯含有量太低，松脂醇二葡萄糖苷不易提取分離，故選擇虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯作為指標成分。另外，虎杖苷在供試品溶液中含有量高，位置適中，峰形好，分離度大，故選擇其作為內(nèi)標。

3.2 前處理方法選擇 本實驗比較了乙醇、甲醇，發(fā)現(xiàn)后者提取率高，基線平穩(wěn)，圖譜指紋性強，故選擇甲醇作為提取溶劑；比較了超聲提取、回流提取、索氏提取，發(fā)現(xiàn)三者無明顯差異，但超聲提取操作方便快捷，易于制備供試品溶液，故選擇其作為提取方法；比較了提取時間50、60、70 min，發(fā)現(xiàn)提取60 min 后各成分提取率基本一致，故選擇60 min 作為提取時間。

3.3 色譜條件選擇 本實驗所測成分的極性相差較大，故采用梯度洗脫模式以實現(xiàn)快速分離?？疾炝思状?水、甲醇?磷酸、甲醇?醋酸、乙腈?水、乙腈?磷酸、乙腈?醋酸，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.5%磷酸洗脫效果最好，故以其為流動相。各成分紫外吸收波長分別為虎杖苷306 nm、阿魏酸316 nm、蛇床子素330 nm、二氫歐山芹醇當歸酸酯330 nm，四者比較接近，采用DAD 檢測器進行190～400 nm 全波長掃描，通過分析三維圖譜，兼顧信號強度和檢測靈敏度，發(fā)現(xiàn)在330 nm 波長附近各成分色譜圖的基線噪音較低，均有較高的響應(yīng)，有利于含有量測定，故選擇其作為檢測波長。

4 結(jié)論

指紋圖譜具有整體性、相似性的特點，可快速判斷藥味是否缺少，但不能準確反映化學(xué)成分信息；一測多評法定量準確，但受制于中藥的復(fù)雜性，也并非所有活性成分均能如此測定。本實驗首次建立通絡(luò)止痛膠囊HPLC 指紋圖譜，并通過一測多評法同時測定虎杖苷、阿魏酸、蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的含有量，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與外標法接近，而且該方法簡便高效，重復(fù)性好，可為該制劑整體質(zhì)量控制提供參考。