馬靜雅 時(shí)瀟麗 劉 力

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 上海200021）

鹿角方由鹿角膠、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、山茱萸、女貞子、陳皮6 味藥材組成，來源于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科胡婉英教授［1］。該方是依據(jù)“水火既濟(jì)，心腎相關(guān)” “從腎治心” 的中醫(yī)理論，結(jié)合多年臨床實(shí)踐擬定的治療慢性心力衰竭的補(bǔ)腎強(qiáng)心方，已在臨床上安全使用二十余年，療效確切。

現(xiàn)代藥理和臨床研究表明，鹿角方具有改善心腎功能［2］、抑制心肌肥厚［3］、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化及心室重構(gòu)［4］等作用。課題組前期建立液質(zhì)聯(lián)用方法同時(shí)測定復(fù)方鹿角顆粒中18 種氨基酸［5］、13 種成分［6］的含有量，并對其入血成分［7］及心臟組織分布［8］進(jìn)行了初步分析，但目前尚無關(guān)于它在慢性心力衰竭大鼠中腎臟分布的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上采用液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用（LC?MS／MS）法，對鹿角方中10 種成分在慢性心力衰竭大鼠左右腎臟中的組織分布進(jìn)行分析，以期為該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及發(fā)揮“從腎治心” 作用的研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Triple?Quad 4500 質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司），含三重四極桿線性離子肼串聯(lián)質(zhì)量分析器、ESI 離子源、Analyst Software 色譜工作站；TG332A 微量分析天平、FA2004 電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SK7200B 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；VtexMixer VX200 渦旋混合器（美國Labnet 公司）；LEGEND MICRO 21R 高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific 公司）；NDK200?2 氮吹儀 （杭州米歐儀器有限公司）；F610 手持組織勻漿機(jī)、JXFSTPR?24 自動勻漿機(jī)（上海凈信科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 鹿角方浸膏由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑實(shí)驗(yàn)室制得，每1 g 浸膏粉含5.13 g 生藥。馬錢苷（批號111640?201005）、柚皮苷 （批號 110722?201312）、橙皮苷 （批號110721?201818）、補(bǔ)骨脂素 （批號 110739?200814）、異補(bǔ)骨脂素（批號110738?201715）、淫羊藿苷（批號110737?200415）、寶藿苷Ⅰ（批號113558?15?9） 對照品及瑞格列奈（批號100753?201303） 均購自中國食品藥品檢定研究院。朝藿定A （批號 110623?72?8）、朝藿定 B （批號110623?73?9）、朝藿定C （批號111780?201503）對照品均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，均購自德國CNW公司。

1.3 動物 SPF 級Wistar 雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物使用許可證號SYXK （滬） 2014?0008，在18～24 ℃下飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。研究已獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理實(shí)驗(yàn)委員會批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Phenomenex Luna?C18色譜柱（2.0 mm×100 mm，5 μm）；流動相水（A） ?乙腈（B） ?0.1%甲酸（C），洗針液50%甲醇，梯度洗脫（0～0.1 min，9% B，90% C；0.1～6.0 min，9%～36%B，90%～60% C；6.0～9.0 min，36%～72%B，60%～20% C；9.0～10.0 min，72%～81%B，20%～10%C；10.0～12.0 min，81%B，10%C；12～ 12.01 min，81%～ 9%B，10%～ 90%C；12.01～15.0 min，9%B，90%C ）；體積流量0.8 mL／min；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣25 psi （1 psi ＝0.133 kPa）；碰撞氣9 psi，離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣壓55 V；輔助氣壓55 V；去簇電壓、射入電壓、碰撞能量、碰撞室射出電壓見表1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，各精密吸取適量，50%甲醇稀釋，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取瑞格列奈適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，精密吸取適量，50%甲醇稀釋，即得（50 ng／mL）。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液 取300 μL 空白腎組織勻漿液，精密加入對照品、內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL 后進(jìn)行預(yù)處理，即得（馬錢苷、柚皮苷、橙皮苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、寶藿苷Ⅰ質(zhì)量濃度分別為0.072～72、0.144～144、0.096～96、0.072～72、0.072～72、0.072～72、0.036～36、0.481～481、0.572～572、0.024～24 ng／mL）。同法制備質(zhì)量控制樣品溶液。

表1 質(zhì)譜選擇器通道及相關(guān)參數(shù)Tab.1 MS selector channels and relative parameters

2.3 樣品預(yù)處理 采用乙腈沉淀蛋白法。精密吸取300 μL 空白腎組織勻漿液，精密加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻1 min 后精密加入4 倍量乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，4 ℃下10 000 r／min 離心10 min，取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈桑瑵饪s后精密加入150 μL 50% 甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩2 min，4 ℃下10 000 r／min 離心10 min，吸取上清液進(jìn)行LC?MS／MS分析。

2.4 慢性心力衰竭大鼠模型建立 參考文獻(xiàn)［9］，大鼠術(shù)前禁食，腹腔注射4%水合氯醛麻醉后仰臥位固定，于劍突下0.5 cm 處沿腹白線依次打開腹腔，用已浸潤過生理鹽水的棉球撥開腸道，在左腎上緣鈍性分開后腹膜等軟組織，暴露腹主動脈，在雙側(cè)腎動脈之間分離腹主動脈，用4?0 號真絲編織線將腹主動脈與6 號鈍頭不銹鋼針結(jié)扎，待線扎緊后取出不銹鋼針，結(jié)扎處明顯窄縮時(shí)依次縫合肌層、皮膚；假手術(shù)組大鼠開腹、暴露主動脈后不結(jié)扎，其余操作步驟同模型組。術(shù)后大鼠保溫，肌肉注射青霉素，連續(xù)3 d，每天1 次。

2.5 給藥方案及腎組織采集 建模后，將存活的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及鹿角方低劑量組（0.16 g／mL）、中劑量組（0.31 g／mL）、高劑量組（0.63 g／mL）（分別取鹿角方浸膏粉8、15.5、31.5 g 于離心管中，加水定容至50 mL），假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予蒸餾水，鹿角方各劑量組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物混懸液，各組給藥劑量均為7 mL／kg，每天1 次，連續(xù)30 周。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在末次灌胃給藥后2 h 麻醉大鼠，腹主動脈取血，置于離心管中，迅速取出左右腎臟，生理鹽水清洗殘留血液，加入4 倍量蒸餾水勻漿，-80 ℃下保存。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料以（） 表示，組間比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用線性擬合方法，分析各成分含有量與給藥劑量的關(guān)系。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性、靈敏度試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)比較了6 批空白大鼠腎組織勻漿樣品、質(zhì)量濃度定量下限腎組織勻漿樣品、給藥后2 h 腎組織勻漿樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)勻漿液中內(nèi)源物質(zhì)在相應(yīng)出峰時(shí)間不干擾樣品測定，同時(shí)以信噪比（S／N） ≥10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量下限，各成分峰形理想，表明該方法專屬性、靈敏度良好，見圖1。

2.7.2 線性關(guān)系考察 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.3 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備質(zhì)量控制樣品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下方法預(yù)處理，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，同一天內(nèi)進(jìn)行6 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，每天1 次，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表3，可知該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。

2.7.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備質(zhì)量控制樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6 份，按“2.3” 項(xiàng)下方法預(yù)處理，在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，記錄各成分、內(nèi)標(biāo)峰面積；取空白腎組織勻漿液，按“2.3” 項(xiàng)下方法預(yù)處理（至“常溫下氮?dú)獯蹈伞?為止），加入相應(yīng)質(zhì)量濃度對照品、內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，再精密加入130 μL 50%甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩3 min，4 ℃下10 000 r／min離心5 min，取10 μL 上清液進(jìn)行分析；平行配制相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下方法預(yù)處理，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6 份，結(jié)果見表4，可知該方法基質(zhì)效應(yīng)良好。

圖1 各成分LC?MS／MS 色譜圖Fig.1 LC?MS／MS chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Liner relationships of various constituents

2.7.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備質(zhì)量控制樣品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行6 份，分別考察其在室溫下放置6 h，4 ℃下自動進(jìn)樣器中放置24、48 h，反復(fù)凍融3 次后的穩(wěn)定性，結(jié)果見表5，可知該方法穩(wěn)定性良好。

2.8 腎組織分布 表6 顯示，同一劑量組內(nèi)各成分在大鼠左右腎臟中的含有量無明顯差異（P＞0.05），但除了鹿角方中劑量組寶藿苷Ⅰ外，各組其他9 種成分在左腎中的含有量低于右腎中，以柚皮苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素更明顯。再對各成分含有量與給藥劑量的關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果見表7，可知其含有量均隨著給藥劑量增加而升高。另外，很難測定鹿角方低劑量組朝藿定A 含有量，而且橙皮苷、柚皮苷、朝藿定B、朝藿定C 含有量也相對較低。

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)認(rèn)為，心屬火藏神，腎屬水藏精，水火既濟(jì)是指以上兩臟互相作用、互相制約以維持正常的生理活動［10］。慢性心力衰竭病機(jī)為心氣虛，漸至氣虛及陽，日久及腎，以致心腎陽虛，瘀水內(nèi)停，屬心腎同病之證，這可為鹿角方以“溫腎求強(qiáng)心”“從腎治心” 理論治療該疾病提供依據(jù)。

表3 各成分精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of precision and accuracy tests for various constituents （n＝6）

表4 各成分回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery and matrix effect tests for various constituents （n＝6）

表5 各成分穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.5 Results of stability tests for various constituents （n＝6）

表6 各成分在大鼠左右腎臟中的組織分布（ng／g，， n＝4～6）Tab.6 Tissue distribution of various constituents in the left and right kidneys of rats （ng／g，， n＝4-6）

表6 各成分在大鼠左右腎臟中的組織分布（ng／g，， n＝4～6）Tab.6 Tissue distribution of various constituents in the left and right kidneys of rats （ng／g，， n＝4-6）

注：—表示該成分含有量低于定量下限，無法測定。

本實(shí)驗(yàn)采用腹主動脈縮窄方法，建立慢性心力衰竭大鼠模型。腹主動脈縮窄部分位于左腎腎動脈與右腎腎動脈之間，而左腎位于縮窄處的下方，與右腎相比其縮窄造成的血流量明顯減少，并且質(zhì)量更小，同時(shí)有一部分出現(xiàn)萎縮。因此，血供減少可能是導(dǎo)致鹿角方中馬錢苷、柚皮苷、橙皮苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含有量在大鼠左腎中偏低的主要原因。

表7 各成分含有量與給藥劑量的關(guān)系Tab.7 Relationships between the contents of various constituents and administration doses

淫羊藿苷［11］、朝藿定C［12］、馬錢苷［13］、橙皮苷［14］、柚皮苷［15］等化合物均可改善腎臟損傷，本實(shí)驗(yàn)對上述入血成分在慢性心力衰竭大鼠腎組織中的含有量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均能檢測出，可能是鹿角方改善腎功能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。灌胃2 h 后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、馬錢苷含有量較高，而其他含有量較低的成分為黃酮。研究表明，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 在體內(nèi)可轉(zhuǎn)換成次級苷，后者滲透性好，更有利于吸收入血［16］，其代謝成分有待進(jìn)一步考察。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次研究鹿角方在慢性心力衰竭大鼠左右腎臟中的組織分布，建立LC?MS／MS法對方中10 種活性成分（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、馬錢苷、柚皮苷、橙皮苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ） 進(jìn)行定量分析，并進(jìn)行方法學(xué)、腎組織分布考察。這有助于進(jìn)一步研究鹿角方治療慢性心力衰竭的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也為研究該方發(fā)揮“心腎相交” “從腎治心”作用的機(jī)制提供借鑒。