王 暉 劉 敏 劉 磊 李 雪*

1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 徐州 221006;2.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221004

益肺清解湯為我院自制制劑，委托江蘇省頤海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)灌裝。處方根據(jù)江蘇省中醫(yī)藥管理局印發(fā)的《江蘇省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)辯證方案(試行第一版)》的預(yù)防處方，由黃芪、蘇葉、防風(fēng)、金銀花、薄荷、麥冬、甘草七味藥制得，功效為益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪。主要用于我院醫(yī)護(hù)人員預(yù)防新型冠狀病毒使用，可提高人體正氣，抵御外邪。由于處方中黃芪為君藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗之功效，金銀花作為臣藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效[1]，兩藥為方中起主要作用的成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)查閱文獻(xiàn)和反復(fù)摸索，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的含量。該實(shí)驗(yàn)方法易于操作，專屬性、重復(fù)性和精密度均較好，測(cè)定結(jié)果可靠，可用于我院該自制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器和材料

1.1 儀器 美國(guó)Waters高效液相色譜儀(含1525型二元高效液相色譜泵、717型自動(dòng)進(jìn)樣器、2847型雙波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器和Empower色譜數(shù)據(jù)處理工作站)；日本島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)；上海精密科學(xué)儀器公司 FA1004B型電子天平、雷磁pHS-3B型精密pH計(jì)。

1.2 試藥與試劑 益肺清解湯樣品來(lái)自本院制劑室(江蘇省頤海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)灌裝)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：120225，純度≥98%)、綠原酸(批號(hào)：wkq07050201，純度≥98%)均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜純、水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱采用Waters公司Xterra?RP18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。流動(dòng)相：乙腈(流動(dòng)相A)-0.1%甲酸(流動(dòng)相B)按照下面表1中程序進(jìn)行梯度洗脫。流速為1.2 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。在上述條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸峰形良好，兩種成分色譜峰的理論塔板數(shù)均大于10000，與干擾峰的分離度均大于2.5，保留時(shí)間分別約為13.3 min、10.2 min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別用電子天平精密稱量毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品11.57 mg、綠原酸對(duì)照品20.89 mg，置同一10 mL容量瓶中，加入50%的乙腈水溶液溶解，并滴定至刻度，搖勻，制得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(每1 mL中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.157 mg、綠原酸2.089 mg)，再精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%的乙腈水溶液，滴定至刻度(每1 mL溶液中含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.1157 mg、綠原酸0.2089 mg)，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取益肺清解湯合劑5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入50%乙腈水溶液，滴定至刻度，搖勻，用濾紙濾過(guò)，續(xù)濾液再用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備 按益肺清解湯處方制備缺少黃芪、金銀花藥材的陰性樣品，依照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，即得。

2.3 結(jié)果

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 在上述2.1的色譜條件下，分別取2.2中制得的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性供試品溶液3種溶液適量，分別裝入高效液相色譜儀進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸均分離較好，無(wú)干擾，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)建立的系統(tǒng)對(duì)成分的檢測(cè)專屬性較好。

2.3.2 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀釋滴定至刻度，搖勻，即得。各種濃度的對(duì)照品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積。以所含標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量X(μg)作橫坐標(biāo)，峰面積積分平均值(Y)作作縱坐標(biāo)，計(jì)算并進(jìn)行線性回歸，實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果：毛蕊異黃酮葡萄糖苷：Y=5860.32X+14.78，r=0.9999；綠原酸：Y=2816.7X+10.20，r=0.9998；表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.023～0.463 μg，綠原酸進(jìn)樣量在0.042～0.836 μg線性關(guān)系良好，符合定量要求。

2.3.3 檢測(cè)限和定量限 取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，分別等倍逐級(jí)稀釋進(jìn)樣測(cè)定3次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1，計(jì)算測(cè)得檢測(cè)限分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.58 ng、綠原酸0.81 ng；當(dāng)信噪比為10:1時(shí)，得定量限分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.80 ng、綠原酸2.75 ng。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取經(jīng)2.2.1項(xiàng)方法制備的益肺清解湯(批號(hào)：2002101)供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣試驗(yàn)，分別在0、2、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸兩種成分，按色譜峰面積計(jì)算所得的RSD分別為0.32%和0.75%，說(shuō)明供試品溶液在48 h內(nèi)室溫保存，溶液質(zhì)量穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的一批益肺清解湯溶液(批號(hào)：20120210)9份，分別精密加入2.2.1項(xiàng)下制備的低、中、高3種不同濃度(相當(dāng)于供試品溶液濃度的80%、100%、120%)的混合對(duì)照品溶液，再按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，每個(gè)濃度的樣品制備3份，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密取經(jīng)2.2.1項(xiàng)方法制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)峰面積進(jìn)行分析計(jì)算。計(jì)算結(jié)果顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸峰面積的RSD分別為0.25%、0.24%，結(jié)果表明使用該系統(tǒng)測(cè)量的精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取一批益肺清解湯溶液樣品(批號(hào)：2002101)6份，每份1.0 mL。按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，制得的樣品按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算，結(jié)果顯示每1 mL樣品中含毛蕊異黃酮葡萄糖苷40.95 μg，RSD為0.25%；含綠原酸109.05 mg，RSD=0.38%，結(jié)果表明使用該系統(tǒng)測(cè)量的重復(fù)性良好。

2.3.8 樣品測(cè)定 取樣品5批次(批號(hào)分別為2002101、2002102、2002103、2002111、2002112)，分別按2.2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析計(jì)算，結(jié)果益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的含量(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 供試品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)成分的選擇 黃芪、金銀花為處方中的主要藥效藥材，目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)對(duì)其同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。藥典中黃芪以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，金銀花以綠原酸進(jìn)行為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，而黃芪甲苷因無(wú)紫外吸收，因此本實(shí)驗(yàn)選取方中的有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸進(jìn)行定量測(cè)定分析研究；單獨(dú)對(duì)兩種定量分析已有相關(guān)報(bào)道[2-3]，本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定2個(gè)成分含量，更能有效控制該自制制劑的質(zhì)量。

3.2 分離條件的選擇 實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)采用了多種方法進(jìn)行成分分離[4-6]：乙腈-水梯度洗脫；乙腈-0.1%冰醋酸梯度；甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為有機(jī)流動(dòng)相出峰時(shí)間較長(zhǎng)且峰較寬，分離度較差；而如果水中不加入酸調(diào)節(jié)流動(dòng)性pH值的情況下綠原酸的色譜峰難以洗脫檢測(cè)出來(lái)。最后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，所測(cè)的兩種成分與干擾成分得到較好的分離，保留時(shí)間也合適，峰形達(dá)到HPLC定量的要求。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 利用紫外分光光度計(jì)對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸進(jìn)行吸收光譜掃描，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在259 nm和320 nm有吸收峰，綠原酸在327 nm有最大吸收峰，結(jié)合色譜圖并參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道[7-9]，本實(shí)驗(yàn)采用320 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，兩種成分均能獲得較好的信號(hào)響應(yīng)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相的方法對(duì)益肺清解湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，對(duì)色譜條件進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了同一色譜條件下的分離和含量測(cè)定。該方法操作簡(jiǎn)單，且精密度、重復(fù)性和回收率均符合中國(guó)藥典中高效液相定量的要求，為同時(shí)測(cè)定中藥成方合劑中多成分的研究提供一定的參考，并可作為我院該自制制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。