何娥英 胡中盛 殷久和 孫蒙蒙*

1.安徽滬譙醫(yī)藥有限公司，安徽 亳州 236800；2.亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800

女貞子為木犀科植物女貞的干燥成熟果實(shí)。其最早記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》，性涼，味甘、苦，歸肺、肝、腎經(jīng)，主要產(chǎn)收于我國(guó)浙江、安徽、湖南、江蘇等地[1-2]，果實(shí)一般在冬季成熟，采收時(shí)除去枝葉，然后放入沸水中略微燙后或者放于鍋中稍蒸，干燥。女貞子的最初炮制見(jiàn)于宋代“飯上蒸”(《瘡瘍》)；其次，明代有用酒、旱蓮草及地黃制(《蒙荃》)、酒浸蒸曬(《通玄》)、酒拌黑豆蒸九次(《打法》)、酒拌(《醒齋》)、酒蜜拌蒸暴露七日夜(《瑤函》)等方法[3]。

中藥女貞子中主要活性成分之一是環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物，以裂環(huán)環(huán)烯醚萜類(lèi)為主，主要化合物包括女貞苷、特女貞苷等[4]。女貞子中的紅景天苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎等作用，特女貞苷具有抗腫瘤作用，女貞苷 G13 具有抗骨質(zhì)疏松作用[5-6]。HUANG X J 等[7]首次從女貞子中分離得到 1α 構(gòu)型環(huán)烯醚萜，并解釋了該化合物成分的生物合成途徑，進(jìn)一步豐富了女貞子中環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物的種類(lèi)。女貞子生品中環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物特女貞苷含量較高，使其保肝利膽、抗腫瘤、降血脂等作用顯著，酒制后，由于特女貞苷在高溫和水蒸氣條件下不穩(wěn)定，水解生成苯乙醇類(lèi)化合物紅景天苷，增強(qiáng)了女貞子抗心肌缺血、抗肝、腎纖維化的作用，女貞子酒制后滋補(bǔ)肝腎作用顯著與炮制過(guò)程中環(huán)烯醚萜類(lèi)成分發(fā)生水解轉(zhuǎn)化關(guān)系密切[8]。通過(guò)肖薇等[9]對(duì)女貞子生品、醋制女貞子、鹽制女貞子和酒制女貞子的研究分析，比較反相高效液相色譜中不同炮制規(guī)格女貞子的有效成分齊墩果酸和特女貞苷進(jìn)行含量對(duì)比，結(jié)果顯示生品女貞子和3種不同炮制品中齊墩果酸有效含量高低順序?yàn)榕懽由?醋制女貞子<鹽制女貞子<酒制女貞子。3種不同炮制方法得到的樣品和生品女貞子中特女貞苷含量排列順序?yàn)榇字婆懽?酒制女貞子<生品女貞子<鹽制女貞子，說(shuō)明女貞子的不同炮制方法對(duì)其主要有效成分齊墩果酸和特女貞苷的含量具有一定程度的影響。使用數(shù)控蒸煮鍋為蒸制設(shè)備采用L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[10]，以有效成分特女貞苷的含量和酒蒸后女貞子外觀質(zhì)量為檢測(cè)指標(biāo)，找出適合酒制女貞子的生產(chǎn)工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 賽默飛U300高效液相色譜儀(檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器)、SK8200B型數(shù)控超聲清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、GB/T26497型萬(wàn)分之一分析天平(奧素斯儀器有限公司)、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、萬(wàn)能高速粉碎機(jī)(上海道宏商貿(mào)有限公司)、數(shù)控中藥蒸煮鍋(康華制藥機(jī)械有限公司)。

1.2 藥品與試藥 特女貞苷對(duì)照品(批號(hào)為39011-92-2)供含量測(cè)定用；甲醇為一級(jí)色譜純(天津四友)；水為純化水；稀乙醇為分析純；女貞子藥材購(gòu)于安徽省滁州市皇浦藥材棧；黃酒采購(gòu)于亳州市恒碩發(fā)酵制品有限責(zé)任公司，酒精度數(shù)≥10 Vol。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 特女貞苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：依利特Hypersil ODS2 250 mm×4.6 mm，5 μm，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相：甲醇—水(40∶60)；檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm。流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取特女貞苷對(duì)照品適量于容量瓶中，加入甲醇配制成每毫升含0.25 mg特女貞苷的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定粉碎后的女貞子藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，連接冷凝管加熱回流1 h，放涼，再次稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即可得到制備的供試品溶液。

2.1.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取供試品溶液10 μL與對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，按照4.1.1高效液相色譜法的測(cè)定的條件，測(cè)定，然后計(jì)算女貞子藥材中特女貞苷的含量[4]。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取 4.1.2 所制備的特女貞苷對(duì)照品溶液各1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL注入高效液相色譜儀中按照高效液色譜法進(jìn)行測(cè)定，記錄各個(gè)不同進(jìn)樣體積下測(cè)得的特女貞苷的峰面積數(shù)值，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量(μg)、縱坐標(biāo)為峰面積，用特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定線性范圍。由圖1、圖2可知特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=790.45x+31066，R2= 0.99762,說(shuō)明進(jìn)樣量在0.2954～1.4770 μg線性良好。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取 4.1.2 所制備的特女貞苷對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次注入高效液相色譜儀中按照高效液色譜法測(cè)定，記錄特女貞苷的峰面積，并計(jì)算RSD值小于3 %，說(shuō)明特女貞苷含量測(cè)定方法精密度良好。

2.2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)用分析 天平精密稱取粉碎后的酒女貞子藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)0.5 g，平行稱取5份，按照上述供試品溶液制備方法，制備所需要的供試品溶液，用高效液相色譜法測(cè)定，進(jìn)樣10 μL。計(jì)算RSD和特女貞苷的平均含量。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取粉碎后的女貞子藥材粉末0.5 g，按照上述供試品溶液制備方法，制備所需要的供試品溶液，然后用高效液相色譜法測(cè)定特女貞苷的含量在供試品溶液中的含有量，每次間隔一個(gè)小時(shí)進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣9次，記錄峰面積積分，測(cè)得特女貞苷含量，計(jì)算RSD值小于3 %，說(shuō)明特女貞苷含量測(cè)定中供試品溶液在8 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)得特女貞苷含量平均值為3.160 %的女貞子藥材，粉碎后過(guò)3號(hào)篩，平行稱取5份粉末，每份約0.5 g，5份粉末中各加入精密稱定的特女貞苷對(duì)照品1 mL，依照《中國(guó)藥典》(2015年版)有關(guān)供試品溶液制備的方法，制備供試品溶液，按照高效液相色譜法測(cè)定供試品溶液中特女貞苷的含量，記錄峰面積，計(jì)算分析加樣回收率平均值為98.2%，RSD=0.8105%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 單因素考察試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)考察潤(rùn)法中悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)女貞子藥材性狀的影響，稱取女貞子藥材4份每份100 g，加相同稀釋倍數(shù)的黃酒，分別悶潤(rùn)0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，觀察女貞子藥材性狀。蒸法中蒸制溫度以及蒸制時(shí)間對(duì)藥材性狀的影響，分別稱取女貞子藥材4份，每份100 g，蒸制溫度分別為100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃，蒸制時(shí)間分別為4 h、6 h、8 h、10 h，觀察藥材性狀。干燥法中不同干燥溫度對(duì)藥材性狀的影響，干燥溫度分別為陰干、60 ℃、80 ℃、100 ℃，觀察藥材性狀。見(jiàn)表1。

由表1可知，悶潤(rùn)時(shí)間以1 h為宜；酒蒸后女貞子的外觀性狀與蒸制時(shí)間和蒸制溫度存在顯著性的影響；藥材的性狀與干燥溫度不存在顯著性影響，考慮生產(chǎn)成本與效率選擇在80℃下干燥。

表1 單因素考察藥材性狀表

3.2 正交試驗(yàn)

3.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照《中國(guó)藥典》(2015年版)關(guān)于女貞子藥材的炮制是依照酒燉法或酒蒸法使酒吸盡或蒸透，蒸得的藥材顯黑褐色或灰黑色，聞之有酒香氣，有的上面還附白色的粉霜，但是沒(méi)有確切的規(guī)定蒸制所需要的時(shí)間。部分文獻(xiàn)報(bào)道的蒸制時(shí)間有2 h、3 h、4 h、6 h、8 h，甚至有3 d者[11]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，酒蒸女貞子的質(zhì)量與悶潤(rùn)時(shí)間、加酒量、蒸制時(shí)間、蒸制溫度、干燥溫度存在很重要的關(guān)系，且蒸制時(shí)間在4 h以上，才能滿足《中國(guó)藥典》(2015年版)對(duì)女貞子炮制的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[12]。實(shí)驗(yàn)選取悶潤(rùn)時(shí)間、蒸制時(shí)間、蒸制溫度和干燥溫度作為4個(gè)主要考察因素，各設(shè)定3個(gè)水平，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2。以特女貞苷含量為考察指標(biāo)。取凈女貞子一定量共9份，按表7設(shè)計(jì)依次進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

3.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 由表3通過(guò)R值比較可知，影響酒制女貞子的最關(guān)鍵因素是蒸制時(shí)間，次要因素是拌黃酒后的潤(rùn)制時(shí)間，最次要因素為蒸制溫度和干燥溫度。綜合酒制女貞子成品的外觀性狀和特女貞苷的含量(以干燥品計(jì))，優(yōu)選出最佳的生產(chǎn)工藝條件為A1B2C2D2，即拌黃酒后悶潤(rùn)1 h，蒸制溫度110 ℃，蒸制時(shí)間8 h，80 ℃下干燥。

表3 酒制女貞子正交工作安排及試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

本研究考察了酒女貞子炮制過(guò)程中的潤(rùn)制、蒸制和干燥的指標(biāo)性成分的變化，采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)等方法優(yōu)選最佳工藝。

性狀變化方面，女貞子經(jīng)酒蒸后顏色較原藥材加深變?yōu)楹诤稚蚧液谏?，可能的原因是女貞子中含有的特女貞苷為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)，易水解，苷元聚合而變黑造成的。

指標(biāo)成分變化方面，隨著潤(rùn)制時(shí)間、蒸制時(shí)間和蒸制溫度的增加，特女貞苷含量逐漸降低，原因是特女貞苷含有紅景天苷母核，其性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫作用下可使其水解生成次級(jí)苷——紅景天苷，進(jìn)一步水解生成紅景天苷的苷元——酪醇。

炮制過(guò)程中參數(shù)控制方面，需要重點(diǎn)關(guān)注潤(rùn)制時(shí)間和蒸制時(shí)間。潤(rùn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起女貞子果皮破裂，可能也會(huì)影響女貞子有效成分含量，潤(rùn)時(shí)間過(guò)短會(huì)有干心，果皮稍硬，酒浸不透。蒸制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)女貞子呈黑褐色或灰黑色，但有效成分含量可能會(huì)降低，蒸制時(shí)間過(guò)短，藥材性狀達(dá)不到規(guī)定要求。而干燥溫度對(duì)藥材性狀影響不大。

5 結(jié)論

本研究的目標(biāo)是為確定酒制女貞子的生產(chǎn)工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)以特女貞苷含量和酒蒸后女貞子成品外觀性狀為指標(biāo)，通過(guò)比較得出，酒女貞子的最佳工藝參數(shù)為，拌黃酒后潤(rùn)1 h，110 ℃蒸制8 h，停止加熱，燜一夜，出鍋，80 ℃下干燥。研究過(guò)程中，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定符合酒女貞子炮制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行考察，通過(guò)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)選，并在炮制終點(diǎn)判斷時(shí)關(guān)注性狀變化和指標(biāo)成分含量變化的平衡，特別是性狀的判斷貫穿整個(gè)考察過(guò)程，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合特女貞苷的含量變化，確保炮制所得的酒女貞子性狀和均含量符合中國(guó)藥典的要求。所得工藝參數(shù)可行性良好，適合大生產(chǎn)操作。