祿美云

(昆明市食品藥品檢驗(yàn)研究院 藥品檢驗(yàn)中心，云南 昆明 650100)

明目地黃丸是中成藥中成分較為復(fù)雜的一種，原質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 中藥成方制劑：第9冊》，但該標(biāo)準(zhǔn)中只有茯苓、當(dāng)歸和山藥這3味藥的顯微鑒別．之后，又收載于《中華人民共和國藥典》[1]2015版(以下簡稱《中國藥典》)中，在該藥典中明目地黃丸的處方是由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、白芍、煅石決明等12味藥組成，其具有養(yǎng)肝明目的功效，臨床用于肝腎虛、視物畏光、模糊不清等病癥的治療．其中：馬錢苷為酒萸肉中的主要藥效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗休克等藥理作用[2-6]；牡丹皮具有清熱散淤之功效，而丹皮酚為其主要有效成分之一；芍藥苷有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用[7-9]，是白芍和牡丹皮的主要成分．結(jié)構(gòu)式見圖1～圖3．

《中國藥典》不僅將明目地黃丸中的酒萸肉、白芍、牡丹皮3味藥中的主要藥效成分馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚作為指標(biāo)性成分，并對其含量進(jìn)行測定，進(jìn)而對明目地黃丸的質(zhì)量進(jìn)行控制，同時還規(guī)定：本藥品含酒萸肉以馬錢苷計(jì)算，含牡丹皮以丹皮酚計(jì)算，含白芍和牡丹皮以芍藥苷計(jì)算，且大蜜丸每丸中上述3種成分分別不得少于2.0，3.6，5.4 mg．由于這3種藥效成分的極性相差較大，因此《中國藥典》采用3組色譜條件分別對明目地黃丸中馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的含量進(jìn)行測定，所用方法操作復(fù)雜、費(fèi)時．此外，還有采用在線二維柱切換-超高效液相色譜法測定明目地黃丸中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷及丹皮酚含量的報(bào)道[10-12]，這種方法雖然分離效率較高，但實(shí)驗(yàn)需采用兩種類型的色譜柱，導(dǎo)致操作復(fù)雜．因此，為簡化明目地黃丸(大蜜丸)中有效成分的含量測定方法，本文通過優(yōu)化檢測條件，實(shí)現(xiàn)只采用1套色譜條件，1次進(jìn)樣分析，就可同時定性分析及定量測定3種有效成分的含量，從而建立了一種快捷、高效的測定方法．

由于上述3種中成藥成分的物理、化學(xué)性質(zhì)相差較大，其中：馬錢苷易溶于水，較少溶于乙醇；芍藥苷在堿性條件下不穩(wěn)定，而在酸性條件下穩(wěn)定；丹皮酚易溶于甲醇．因此《中國藥典》采用不同的提取溶劑和條件對酒萸肉、白芍、牡丹皮中3種有效成分進(jìn)行提取，導(dǎo)致操作費(fèi)時[13-15]．綜合分析以上3種成分的性質(zhì)，本文選擇50%的甲醇為供試品中3種成分的提取溶劑和對照品的制備溶劑[16]，通過大量實(shí)驗(yàn)探索優(yōu)化出不同于《中國藥典》和其他文獻(xiàn)的色譜條件及方法，對明目地黃丸中3種主要藥效成分同時提取，提高了樣品前處理的效率，并簡化了3種有效成分樣品提取步驟．通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證明所用方法準(zhǔn)確、精密，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可用于明目地黃丸(大蜜丸)的質(zhì)量控制．

1 儀器與試藥

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器如表1所示．

表1 主要儀器

1.2 試藥

實(shí)驗(yàn)用試劑與試藥見表2．

表2 試劑與試藥

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 色譜條件

色譜柱Eclipse XDB-C18(5 m，4.6 mm×250 mm)，流動相A(0.1%磷酸水溶液)-B(乙睛腈)，流量為 1.0 mL/min，馬錢苷、芍藥苷的檢測波長為236 nm，丹皮酚的檢測波長為274 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL(自動進(jìn)樣器)．在此檢測條件下，各待測組分分離度符合要求，馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的出峰時間分別為10.08，16.41，43.81 min．相應(yīng)的理論塔板數(shù)按馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚計(jì)算應(yīng)分別不低于4 000，4 500，3 500．流動相梯度和檢測波長見表3和表4．

表3 流動相梯度程序

表4 波長檢測程序

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品馬錢苷13.32 mg、芍藥苷12.95 mg和丹皮酚10.42 mg分別于25 mL容量瓶中，以50%甲醇為溶劑定容，搖勻，再取定容后的馬錢苷和丹皮酚對照品溶液2 mL、芍藥苷對照品溶液5 mL，二次定容到50 mL容量瓶中，制成每1 mL中含馬錢苷21.14 μg、丹皮酚16.65 μg、芍藥苷49.57 μg的混合溶液，混合溶液用一次性針頭式濾器(孔徑0.45 μm)過濾，取濾液，采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣5 μL進(jìn)行分析．

2.3 供試品溶液的制備

取明目地黃丸(大蜜丸)，剪碎，分別精密稱定8份，每份1 g，置具塞錐形瓶中，并精密加入50%甲醇25 mL，密塞后稱定質(zhì)量，平均分成4份，分別加熱回流45，60，75，90 min，放冷后稱定其質(zhì)量，并用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過后續(xù)濾液用孔徑為0.45 μm的一次性針頭式濾器過濾，取濾液，采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣5 μL進(jìn)行分析．

2.4 線性關(guān)系考察

按2.2項(xiàng)下制備5個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，再按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖．以對照品質(zhì)量濃度、峰面積分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖4、圖5、圖6，線性關(guān)系見表5．

表5 3種有效成分的線性方程與線性范圍

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，每針 5 μL，記錄各目標(biāo)成分峰面積．得到馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的峰面積的RSD值分別為0.19%，0.30%，0.59%，表明儀器的精密度良好，能滿足實(shí)驗(yàn)定量分析的要求．

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號明目地黃丸(大蜜丸)供試品24 g，按照2.3項(xiàng)下制備樣品6份，進(jìn)樣分析，記錄各目標(biāo)成分峰面積，并計(jì)算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)．得到馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.91%，0.39%，0.44%，表明3種有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定的重復(fù)性符合《中國藥典》要求(待測定成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%以內(nèi)，重復(fù)性要求RSD≤3%)．

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取制備好的同一份供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h吸取5 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定．在上述6個時間段內(nèi)，溶液中的馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的峰面積穩(wěn)定，RSD分別為0.85%，1.20%，0.67%，表明該供試品溶液至少可穩(wěn)定24 h．

2.8 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

使用加標(biāo)回收率考察準(zhǔn)確度．精密量取已知質(zhì)量濃度的同一樣品6份(每份3 mL)置25 mL量瓶中，分別精密加入2.2項(xiàng)下制備好的混合對照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，定容，進(jìn)樣5 μL進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，加標(biāo)回收率的計(jì)算公式為：加標(biāo)回收率=[(實(shí)際測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量]×100%．由表6～表8可見，3種有效成分質(zhì)量濃度測定的準(zhǔn)確度符合《中國藥典》要求(待測定成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%以內(nèi)，回收率限度在90%～108%)．

表6 馬錢苷的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 芍藥苷的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表8 丹皮酚的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品提取時間優(yōu)化

取明目地黃丸(大蜜丸)，剪碎，分別精密稱定8份，每份1 g，置于具塞錐形瓶中，并精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定其質(zhì)量，以兩份為單位平均分成4份，每份加熱回流45，60，75，90 min，放冷，然后稱定其質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足加熱回流過程中減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用一次性針頭式濾器(孔徑0.45 μm)過濾，取濾液，采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣5 μL進(jìn)行分析，記錄色譜圖．結(jié)果表明，提取60 min即可完全提取，且其最終各成分的含量符合《中國藥典》規(guī)定．提取結(jié)果見表9，色譜圖見圖7、圖8．

表9 樣品提取時間及篩選結(jié)果

2.10 樣品實(shí)際測定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用明目地黃丸(大蜜丸)(云南騰藥制藥股份有限公司：批號161240)，平均每丸質(zhì)量9 g．按《中國藥典》的規(guī)定，最終測得每丸中馬錢苷、芍藥苷及丹皮酚的含量，結(jié)果見表10．

表10 每丸中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的含量

3 討論

3.1 色譜柱選擇

本實(shí)驗(yàn)在條件篩選時，曾采用XTERRA RP-C18(18.5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱進(jìn)行檢測分析，然而用短柱分析時，馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的出峰時間分別為5.702，9.602，31.563 min，出峰時間太短，易導(dǎo)致對照品和樣品的峰型不符合要求．此外，丹皮酚由于受到流動相酸性的影響，導(dǎo)致供試品峰不能與雜峰完全分離．最主要的是馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的理論塔板數(shù)不能達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的數(shù)值，只有改用長柱才能滿足分析的需要, 因此本實(shí)驗(yàn)選用 Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱．

3.2 檢測波長選擇

《中國藥典》關(guān)于明目地黃丸的含量測定是，馬錢苷的檢測波長為236 nm，芍藥苷的為230 nm，丹皮酚的為274 nm．而本實(shí)驗(yàn)采用可變波長程序，3種有效成分的檢測波長仍用《中國藥典》的規(guī)定．在實(shí)驗(yàn)中，篩選出波長改變時間程序，在該色譜條件下馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的峰形和分離度均較好，無雜峰的干擾．

3.3 溶劑提取方法選擇

本實(shí)驗(yàn)采用加熱回流提取方法，以50%的甲醇為溶劑，對45，60，75，90 min這4個時間段逐一考察．結(jié)果表明，60 min的提取效果較好，在此時間段內(nèi)樣品的主峰與雜峰分離度很好．

3.4 柱溫選擇

分別考察柱溫35 ℃和40 ℃對樣品測定的影響，結(jié)果顯示，溫度對測定結(jié)果的影響較小，因此選擇柱溫為35 ℃．

3.5 流動相篩選

考察流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，其比例分別為V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=12∶88、V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=15∶85和V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=20∶80．而流動相的比例對樣品的測定影響較大，當(dāng)V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=15∶85為流動相時，馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚與雜質(zhì)峰的分離度最佳，且峰形最好．因此，本實(shí)驗(yàn)采用該流動相．

4 結(jié)語

1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過加熱回流可有效提取明目地黃丸中的馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚，且供試品的前處理較簡便，在所建立的流動相和色譜條件下，無雜峰影響，能滿足明目地黃丸中相關(guān)成分含量測定的基本要求．

2)《中國藥典》中采用3套不同的色譜條件測定明目地黃丸中馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的含量，操作費(fèi)時且樣品前處理較繁瑣．而本文建立了1套可以同時測定3種有效成分的色譜條件，此色譜條件主要是針對《中國藥典》中3種成分的提取溶劑、供試品前處理方法和檢測波長進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的操作方法簡便、高效、節(jié)省時間、準(zhǔn)確度高．因此，所建立的方法可用于明目地黃丸中馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的含量測定．