樊炳君，曹艷茹,2*，紀(jì)開娟，段 嬌，羅昆艷，姚 麗，朱海瑩，侯秀麗

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；3.臨滄市第一中學(xué) 天有實(shí)驗(yàn)學(xué)校，云南 臨滄 677000；4.楚雄州祿豐縣恐龍山鎮(zhèn)人民政府，云南 祿豐 651212)

桉樹(EucalyptusrobustaSmith.)為桃金娘科桉屬重要種，主要分布區(qū)在澳大利亞和其附近的各島嶼[1]．如今，桉樹是世界三大造林樹種(楊樹、桉樹、松樹)之一，也是中國南方最重要的造林樹種．據(jù)統(tǒng)計(jì)，至2005年云南有多達(dá)109個(gè)縣(市、區(qū))種植桉樹，種植面積高達(dá)23.6萬hm2．桉樹不僅被用作經(jīng)濟(jì)林樹種，還可作為大面積的防護(hù)林、用材林和薪炭林[2]．但是種植桉樹給人們帶來經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí)，也給生態(tài)環(huán)境帶來了一些問題．眾所周知，桉樹常被人們稱為樹木界的抽肥機(jī)和抽水機(jī)，長期種植桉樹不僅會(huì)改變土壤的理化性質(zhì)，同時(shí)對(duì)土壤中的微生物種類和數(shù)量也會(huì)產(chǎn)生一定影響．李佳雨等[3]研究發(fā)現(xiàn)，桉樹林土壤中的pH、有機(jī)碳和全氮含量均顯著降低，土壤中叢枝菌根真菌的豐度也隨桉樹種植時(shí)間的增加而減少．李立文[4]在研究桉樹對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，桉樹的根系分泌物和凋落物對(duì)其他物種的生長有一定的抑制作用，從而影響周圍環(huán)境的生物多樣性，造成桉樹林地表面光禿、生物種類單一．陳法霖等[5]發(fā)現(xiàn)，桉樹凋落物提供土壤微生物群落生境和食物的能力較弱，致使土壤中的微生物群落生物量、多樣性和代謝活性均降低．目前國內(nèi)外關(guān)于桉樹人工林生態(tài)系統(tǒng)的報(bào)道[6-9]大多是基于植物和土壤養(yǎng)分的角度，而對(duì)于桉樹根際土壤中放線菌的研究尚不多見．

土壤是植物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，而土壤中的微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量、種類及活性都會(huì)影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)環(huán)境也起著天然的“過濾”和“凈化”作用[10]．放線菌是土壤微生物中的一個(gè)主要類群，它們的存在反映了生態(tài)多樣性，對(duì)自然界物質(zhì)循環(huán)起著重要作用，同時(shí)還是很好的生防菌資源．黃冰紛等[11]從土壤中篩選出對(duì)松材線蟲有較高殺滅活性的放線菌．龍?jiān)拼ǖ萚12]在綜述貴州省的放線菌資源時(shí)分析總結(jié)出17株活性放線菌，功能主要集中在產(chǎn)生活性物質(zhì)、拮抗植物病原菌及具生物防治潛力等方面．此外，放線菌還可以合成多種有用的代謝產(chǎn)物，例如維生素、淀粉酶、纖維素酶和氨基酸等，與人類的生產(chǎn)生活關(guān)系緊密[13]．

雖然近幾年我國有很多學(xué)者已對(duì)桉樹人工林土壤微生物、土壤動(dòng)物和病蟲害防治進(jìn)行研究，但針對(duì)云南桉樹人工林根際土壤中的放線菌研究卻很少．因此，本試驗(yàn)采集云南省牟定縣桉樹人工林的根際土壤，分離其中的放線菌，在分析該地桉樹根際土壤中放線菌的多樣性的基礎(chǔ)上檢測(cè)菌株酶活，以期從根際微生物生態(tài)的角度來探討桉樹人工林的生態(tài)效益和生物多樣性問題．并通過分析桉樹根際土壤放線菌的數(shù)量和種類，闡明桉樹人工林地土壤放線菌的生態(tài)分布規(guī)律，為全面評(píng)估云南桉樹的生態(tài)效應(yīng)，以及后期的桉樹引種、擴(kuò)大栽培面積提供一些理論依據(jù)，同時(shí)獲取一批有價(jià)值的放線菌資源．

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域概況和材料

試驗(yàn)材料采自云南省楚雄州牟定縣(101°35′～101°47′N，25°30′～25°40′E)，境內(nèi)最低海拔 1 140 m，最高海拔 2 897 m，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫為 15.8 ℃，年平均降雨量為 872 mm，日照充足，氣候溫和．

桉樹林根際土壤的采集在上述試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行．在坡向相同、海拔相差在110～ 120 m 的范圍內(nèi)設(shè)置樣方，樣方大小為 10 m × 10 m ，以“S”型取樣法在每個(gè)樣地隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)，除去表層土，取深度為 10 cm 左右的土樣混合為1個(gè)樣品．海拔間隔 200 m 按上述方法再采集1個(gè)樣品，共計(jì)8份桉樹根際土樣，將土樣裝入無菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于 4 ℃ 以待分離．

1.2 分離純化

1.2.1 土樣預(yù)處理

將8份樣品進(jìn)行風(fēng)干(無菌條件下)，過篩(孔徑 2 mm)后，取 2 g 土樣于 100 ℃ 的烘箱中干熱處理 1 h．將上述樣品加入裝有 18 mL 無菌水的錐形瓶，室溫振蕩 30 min，以待涂布分離．

1.2.2 分離培養(yǎng)基

本研究放線菌分離的培養(yǎng)基參照Taechowisan，Khamna，Lece valier和段淑蓉等的方法配制HV培養(yǎng)基[14]、海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基[15]、甘油精氨酸瓊脂[16]、棉籽糖組氨酸培養(yǎng)基[16]、海藻糖-天門冬酰胺培養(yǎng)[17]、土壤浸汁培養(yǎng)基[17]，并結(jié)合楊宇容等[18]的方法在前5個(gè)分離培養(yǎng)基中加入 75 μg/mL 重鉻酸鉀，在第6個(gè)分離培養(yǎng)基中加入 0.06 g/L 制霉菌素，用以抑制細(xì)菌和真菌的生長．

1.2.3 放線菌分離培養(yǎng)及保藏

將上述預(yù)處理好的樣品進(jìn)行梯度稀釋，取 200 μL 質(zhì)量濃度為10-3倍的土壤稀釋液置于培養(yǎng)基上并涂布均勻，靜置 0.5 h 后倒置恒溫培養(yǎng)箱中，溫度為 28 ℃．7～ 21 d 后，觀察并統(tǒng)計(jì)出菌情況，將放線菌單菌落挑取出來，以平板進(jìn)行劃線純化，將純化好的菌株接種于牛奶管、斜面、甘油管，置于低溫保藏．

1.3 放線菌的初步鑒定

根據(jù)形態(tài)特征選取代表菌株，按宮強(qiáng)等人[19]的方法對(duì)代表菌株的總DNA進(jìn)行提取，采用Marchesi等[20]設(shè)計(jì)的引物(PA:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行16S rRNA基因的特異擴(kuò)增，隨后送到美吉測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序．將獲得的16S rRNA基因序列提交到ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/identify)進(jìn)行比對(duì)[21]，調(diào)取相似性較高的菌株序列，利用MEGA 7軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最終確定放線菌種屬．

1.4 放線菌酶活檢測(cè)

對(duì)選取的進(jìn)行初步鑒定的21株代表性菌株進(jìn)行淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和脂肪酶活性檢測(cè)．

1.4.1 菌株活化

將21株放線菌轉(zhuǎn)接到ISP 2培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng) 5 d 后備用．

1.4.2 酶活性檢測(cè)

1)培養(yǎng)基的制備．按照張萬芹等[22]的方法配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基、淀粉酶活檢測(cè)培養(yǎng)基、纖維素酶活檢測(cè)培養(yǎng)基、蛋白酶活檢測(cè)培養(yǎng)基和脂肪酶活檢測(cè)培養(yǎng)基．并根據(jù)不同的水解酶活性檢測(cè)方法，將不同的底物加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中， 同時(shí)平板下層加入水瓊脂層，以便觀察．

2)接種培養(yǎng)．將21株放線菌分別接種到4種酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基上，置于 28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，每株菌每種酶接種兩次，即兩個(gè)重復(fù)．

3)酶活檢測(cè)．纖維素酶活檢測(cè)[23]：在菌株已長好的平板上倒入配置好的剛果紅溶液，待其染色 1 h 后，將染色液倒出，再用NaCl溶液脫色 20 min 后觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)，記錄菌落邊緣與透明圈邊緣的距離，距離越大則酶活越好．

淀粉酶活檢測(cè)：在菌株已長好的平板上倒入適量碘液，若變藍(lán)則表明無酶活；若不變藍(lán)，記錄菌落邊緣與透明圈邊緣的距離，距離越大則酶活越好．

脂肪酶活和蛋白酶活檢測(cè)：如有酶活，菌落邊緣有透明圈形成，記錄其大?。?/p>

2 結(jié)果與分析

經(jīng)分離純化后共獲得73株菌，將其分別保存于牛奶管、甘油管和斜面以進(jìn)行后續(xù)的工作．根據(jù)形態(tài)差異選取了21株代表放線菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析及酶活檢測(cè)．

2.1 放線菌在6種培養(yǎng)基上的出菌情況

放線菌的生長數(shù)量統(tǒng)計(jì)如圖1所示．在采用的6個(gè)培養(yǎng)基上，放線菌的數(shù)量呈現(xiàn)HV培養(yǎng)基≈海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基<海藻糖-天門冬酰胺培養(yǎng)<棉籽糖-組氨酸培養(yǎng)基<甘油-精氨酸瓊脂<土壤浸汁培養(yǎng)基的趨勢(shì)．其中：以采樣地土壤制成的土壤浸汁培養(yǎng)基放線菌出菌率最高，最適合該樣品放線菌的分離；富含有機(jī)質(zhì)的HV培養(yǎng)基和海藻糖-脯氨酸培養(yǎng)基分離效果最差．這可能和該地營養(yǎng)被桉樹強(qiáng)勢(shì)吸收而使得適應(yīng)寡營養(yǎng)的放線菌類群大量存在有關(guān)．

最終，分離純化后共得到73株菌，根據(jù)形態(tài)特征可知其中52株均為鏈霉菌屬菌株．由此可知，桉樹根際土壤放線菌優(yōu)勢(shì)類群是鏈霉菌屬菌株．另選取形態(tài)差異較大的21株代表菌株進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序以及系統(tǒng)進(jìn)化分析．

2.2 分離放線菌的初步鑒定結(jié)果

對(duì)篩選出的21株放線菌進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如表1所示．其中16株屬于鏈霉菌屬；2株屬小單孢菌屬，其中一株是Micromonosporachaiyaphumensis，另一株是M.schwarzwaldensis；1株屬微球菌屬的Micrococcusaloeverae；1株屬考克氏菌屬的Kocuriagwangalliensis；1株為野野村菌屬的Nonomuraeajabiensis．

表1 21株菌株的測(cè)序結(jié)果

測(cè)序的21株放線菌共分布于5個(gè)屬，每個(gè)種選取1個(gè)有效代表菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建．如圖2所示，基于16S rRNA基因序列構(gòu)建了Neighbour-joining進(jìn)化樹．該系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示測(cè)序的21株放線菌中有16株聚在一個(gè)大支上，為鏈霉菌屬菌株．其中，A24和A66-2為同一株菌；而A9，A52-2，A3，A5，A23-1，A69，A23-2都為Streptomycesdecoyicus，且為此次分離菌株的優(yōu)勢(shì)菌株，該菌株可產(chǎn)德夸菌素(decoyinin)和阿洛酮糖素(psicofuranine)，分別可以抑制部分革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌，這也是此次分離到該菌株較多的原因．另外，其可以抑制分枝桿菌和某些腫瘤細(xì)胞[24]．因此，該菌株還可以作為次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的菌株材料．

根據(jù)此次桉樹根際土壤分離的73株放線菌的形態(tài)和測(cè)序結(jié)果可知，68株都為鏈霉菌屬菌株，占到了分離菌株的93%，且在每份樣品中、每種分離培養(yǎng)基上數(shù)量都較多，可見鏈霉菌類群為桉樹根際土的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)放線菌，而僅有7%的分離菌株為其他稀有類群．由此可知，桉樹根際土的放線菌類群組成比較單一．

2.3 潛在新放線菌菌株的分析

分類學(xué)工作者Kim等人[25]于2014年提出16S rRNA 基因序列相似度小于98.65%，可以認(rèn)定為可能的新種或新屬．由測(cè)序結(jié)果表1可知，本次分離到的菌株A45與正式發(fā)表的菌株Streptomycesfuscichromogenes的16S rRNA 基因序列相似度為97.44%，可能為潛在的新菌株；而菌株267與正式發(fā)表的菌株Nonomuraeajabiensis的16S rRNA基因序列相似度為88.19%，可能為潛在的新屬或更高級(jí)別的分類單元．但相關(guān)工作需通過后期的多相分類學(xué)方法來驗(yàn)證．

2.4 酶活篩選結(jié)果

通過點(diǎn)接法將21株代表菌株接種至淀粉、羧甲基纖維素鈉、脫脂牛奶和三丁酸甘油酯為底物的培養(yǎng)基上篩選其酶活．圖3為試驗(yàn)中篩選到的部分陽性結(jié)果，根據(jù)菌落周圍形成的透明圈來判斷酶活是否產(chǎn)生．

21株菌在上述4種底物培養(yǎng)基上生長7 d之后，酶活篩選結(jié)果如表2所示．有4株菌(占篩選菌株總數(shù)的19.0%)脂肪酶活性呈陽性；有7株菌(占篩選菌株總數(shù)的33.3%)淀粉酶活性呈陽性；有6株菌(占篩選菌株總數(shù)的28.6%)纖維素酶活性呈陽性；有5株菌(占篩選菌株總數(shù)的23.8%)蛋白酶活性呈陽性；有7株菌(占篩選菌株總數(shù)的33.3%)的4種酶活都為陰性，即66.7%的菌株都有至少一種酶活．其中，菌株A18 (Streptomycesgeldanamycininus)和菌株267(Nonomuraeajabiensis)具有3種酶活； 而A9(Streptomycessioyaensis)，A24(Streptomycesmauvecolor)，A31(Streptomycesscopuliridis)，A63(Kocuriagwangalliensis)這4株菌都具有兩種酶活，這些活性菌株對(duì)于淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶的開發(fā)應(yīng)用提供了更多研究材料． 在供試的16株鏈霉菌中，有高達(dá)75%的菌株(12株菌)至少有1種酶活，由此說明桉樹根際土壤蘊(yùn)藏著酶活較多的鏈霉菌資源．

表2 21株代表菌株酶活篩選結(jié)果

續(xù)表2

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)云南省楚雄州牟定縣桉樹根際土壤放線菌進(jìn)行了分離，同時(shí)分析了該樣品放線菌的數(shù)量及類群組成，在此基礎(chǔ)上篩選了分離菌株的4種酶活性．通過稀釋平板法從8份桉樹根際土壤樣品中共分離獲得73株放線菌．分離結(jié)果顯示，8份樣品在不同培養(yǎng)基上放線菌的生長情況和數(shù)量差異很大．其中，以采樣地土壤制成的土壤浸汁培養(yǎng)基放線菌出菌率最高，因此土壤浸汁培養(yǎng)基較適合桉樹根際土壤樣品放線菌的分離，推測(cè)可能是由于桉樹大量吸收養(yǎng)分而形成的貧營養(yǎng)環(huán)境的選擇作用使得適應(yīng)寡營養(yǎng)的放線菌類群占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的原因．由此提示，今后在選擇放線菌分離培養(yǎng)基時(shí)要充分調(diào)查考慮采樣地的背景組成特點(diǎn)來設(shè)計(jì)分離培養(yǎng)基，才能得到較為理想的分離效果．

在分離得到的73株菌中，根據(jù)形態(tài)特征可知其中52株均為鏈霉菌屬菌株．另選取形態(tài)差異較大的進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序以及系統(tǒng)進(jìn)化分析的21株代表菌株中有16株也為鏈霉菌屬菌株，一共68株菌(占分離菌株總數(shù)的93.15%)為鏈霉菌的不同種及亞種，說明牟定縣桉樹林根際土中的放線菌優(yōu)勢(shì)類群是鏈霉菌．根據(jù)目前的研究表明，放線菌中數(shù)量最大、應(yīng)用最廣的一類是鏈霉菌．Yu等[26]從來源于廈門紅樹林的1株鏈霉菌中獲得具有抗真菌及抗腫瘤作用的物質(zhì)．謝玉琴等[27]發(fā)現(xiàn)婁徹氏鏈霉菌對(duì)小麥幼苗有很好的促生作用．在本試驗(yàn)中獲得的鏈霉菌屬菌株為后期放線菌的綜合利用及生理活性物質(zhì)的定向篩選提供了較好的物質(zhì)資源．與此同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，楚雄州牟定縣桉樹林根系土壤中的微生物種類單一，物種豐富度不高．生物多樣性會(huì)直接影響一個(gè)地區(qū)甚至一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性．若生物種類單一，則會(huì)導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)十分脆弱．此外，桉樹種植會(huì)干擾林下動(dòng)植物的多樣性[28]．而且，本研究也表明，桉樹的根際土壤放線菌類群較單一，這對(duì)于當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性很不利．

本研究在分離桉樹根際土壤放線菌的基礎(chǔ)上利用平板點(diǎn)接法對(duì)分離放線菌進(jìn)行了酶活檢測(cè)．在篩選的21株放線菌中，有4株菌產(chǎn)脂肪酶，7株菌產(chǎn)淀粉酶，6株菌產(chǎn)纖維素酶，5株菌產(chǎn)蛋白酶，66.7%的篩選菌株至少有一種酶活．可見，桉樹根際土壤放線菌的酶活性比較好，后期可進(jìn)一步詳細(xì)研究酶活陽性菌株的產(chǎn)酶條件等相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，也可利用核糖體工程等更為先進(jìn)的方法對(duì)其進(jìn)行處理改造提高酶的活力和產(chǎn)量，一方面可以提高桉樹根際土壤微生物資源的利用率，另一方面為酶工業(yè)生產(chǎn)提供更多生物資源．