王 雨，王 楠，劉媛媛，李永勤，王巧俠，付建軍

草質(zhì)素是從紅景天、筆筒草、棉花等植物中分離出的一種黃酮類物質(zhì)[1-4]。草質(zhì)素可以通過調(diào)節(jié)人肝癌細胞HepG2細胞活性氧介導(dǎo)的線粒體凋亡通路，促進癌細胞凋亡，達到抗癌的作用。草質(zhì)素還具有較強的抗氧化能力，可以清除氧自由基和抑制蛋白質(zhì)的氧化[5,6]。本研究采取高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠建立NASH模型，研究了草質(zhì)素對動物肝內(nèi)脂肪變性和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑與儀器 40只SPF級雄性SD大鼠購自湖北省武漢市疾病預(yù)防控制中心，6～8周齡【合格證號：SCXK(鄂)2011-0005】。 草質(zhì)素(成都瑞芬思生物公司，純度≥98%)；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料(武漢飼料公司)；檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血紅素氧化酶(HO-1)試劑盒(南京建成生物公司)；抗β-actin、抗Nrf2、抗細胞色素P450酶2E1(CYP2E1)和抗細胞色素P450酶4A(CYP4A，Santa生物公司)；RIPA裂解液、SDS上樣緩沖液、ECL發(fā)光液(碧云天生物公司)；BCA試劑盒(Thermo公司)；Cocktail(Roche生物公司)。臺式低溫高速離心機(Eppendorf公司)；iMARKTM酶標儀(BIO-RAD公司)；電子天平(Sartorius公司)；電熱恒溫水浴箱(精宏實驗設(shè)備有限公司)；旋渦混合器(其林貝爾公司)；電泳儀、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(六一儀器廠)；Imager2000凝膠成像分析儀(Alpha Innotech公司)。

1.2 動物模型的制備 先用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)動物于SPF級動物房1 w。將大鼠分為對照組，用基礎(chǔ)飼料喂食12 w，NASH模型組，用高脂飼料喂食12 w，小劑量草質(zhì)素處理組，在喂食高脂飼料的同時，給予草質(zhì)素20 mg·kg-1，灌胃處理12 w和大劑量草質(zhì)素處理組，在喂食高脂飼料的同時，給予草質(zhì)素40 mg·kg-1，灌胃處理12 w。實驗結(jié)束時，禁食12 h，經(jīng)眼眶取血，斷頸處死動物，取肝臟。

1.3 肝勻漿生化指標檢測 取0.2 g肝組織，加生理鹽水1.8 ml，在冰水浴中勻漿，檢測TG、TC、FFA、MDA、SOD、CAT、GSH-Px和HO-1酶活性。

1.4 肝組織蛋白表達檢測 采用Western blotting法，取肝組織50 mg，加入裂解液0.5 ml，勻漿，冰上裂解30 min，將得到的液體以12000 g在4℃離心15 min，上清即為總蛋白。檢測蛋白濃度，每管分裝50 μg，水浴變性，溫度為100℃，處理10 min。用SDS-PAGE膠電泳，分離總蛋白，保留目標蛋白并電轉(zhuǎn)至PVDF膜，與特異性的一抗和二抗在37℃各孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光液顯色，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝指數(shù)的變化 與對照組比，模型組體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量藥物處理組肝質(zhì)量和肝指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，大劑量組體質(zhì)量也顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)比較

2.2 各組大鼠血生化指標比較 與對照組比，模型組大鼠血清ALT、AST、LDL-C、TG、TC、FFA均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量草質(zhì)素處理組大鼠血清ALT、AST、LDL-C、TG、TC和FFA水平均顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血生化指標比較

2.3 各組大鼠肝勻漿脂質(zhì)含量比較 與對照組比，模型組大鼠肝勻漿TG、TC和FFA水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比，小劑量和大劑量組肝勻漿TG、TC和FFA水平顯著降低(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠肝勻漿脂質(zhì)含量比較

2.4 各組大鼠肝勻漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較 與對照組比，模型組大鼠肝勻漿MDA水平升高(P<0.01)，而SOD、CAT、GSH-Px和HO-1水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比，小劑量和大劑量組肝勻漿MDA水平顯著降低(P<0.01)，而SOD、CAT、GSH-Px和HO-1水平顯著升高(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠肝勻漿氧化應(yīng)激相關(guān)指標比較

2.5 各組肝組織蛋白表達情況比較 與對照組比，模型組大鼠肝組織Nrf2蛋白相對表達量降低(P<0.01)，而CYP2E1和CYP4A蛋白相對表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組比，小劑量和大劑量草質(zhì)素處理組肝組織Nrf2蛋白相對表達量升高(P<0.01)，而CYP2E1和CYP4A蛋白相對表達量降低(P<0.05，圖1)。

3 討論

草質(zhì)素是紅景天屬的植物中主要的黃酮類化合物，紅景天是《神農(nóng)本草經(jīng)》中的上品，越來越多的研究證明紅景天中黃酮類物質(zhì)的藥理活性比其中的苷類和多糖類更優(yōu)，而紅景天黃酮類化合物最主要的藥理作用包括抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和護肝作用[7-10]。

圖1 各組大鼠肝組織蛋白表達量比較與對照組比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比；*P<0.05，**P<0.01

因此，紅景天黃酮類物質(zhì)在治療NASH方面有良好的前景。

本研究結(jié)果顯示，模型組血清FFA水平升高，可以反映出肝臟脂質(zhì)堆積。應(yīng)用草質(zhì)素處理可以降低肝內(nèi)脂肪堆積，說明草質(zhì)素可以改善高脂飲食引起的肝臟脂肪變，緩解第一次打擊帶來的損傷[11,12]。肝臟MDA含量檢測結(jié)果顯示，高脂飲食會導(dǎo)致大鼠肝勻漿MDA含量增加，草質(zhì)素可以降低模型組大鼠肝勻漿MDA含量，說明草質(zhì)素可以緩解高脂飲食引起的氧化損傷。SOD、CAT、GSH-Px和HO-1是機體抗氧化防御系統(tǒng)最主要的組成成分，可以清除大部分的自由基，維持氧化系統(tǒng)的平衡[13-17]。高脂飲食會抑制SD大鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px和HO-1酶活性，同時給予草質(zhì)素灌胃可以提高這些酶的活性，提高機體抗氧化能力。Nrf2是細胞內(nèi)抗氧化還原反應(yīng)最核心的調(diào)節(jié)因子，它不僅可以提高機體清除自由基的能力，還可以抑制自由基的生成。CYP2E1和CYP4A是主要生成自由基的酶系，與NASH患者體內(nèi)氧化應(yīng)激失衡有密切的關(guān)系[18]。本研究結(jié)果顯示高脂飲食會抑制Nrf2蛋白表達，而促進CYP2E1和CYP4A蛋白表達。給予草質(zhì)素可以促進Nrf2的表達，抑制CYP2E1和CYP4A表達。根據(jù)這些結(jié)果，我們推測草質(zhì)素可能主要是通過激活大鼠肝臟Nrf2表達，提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO-1活性，促進機體自由基的清除速度。抑制自由基生成酶CYP2E1和CYP4A的表達，抑制自由基產(chǎn)生，降低肝臟自由基含量，減緩脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低了MDA含量，改善了氧化應(yīng)激紊亂，緩解了第二次打擊的傷害[19，20]。