吳 剛，陳訓(xùn)軍，張萬(wàn)里，李 芬

姜黃素是一種多酚類化合物，可從天南星科和姜科植物的根莖中分離得到，具有多種藥理學(xué)活性，包括保護(hù)肝臟、降脂、抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用等，還可以通過(guò)修復(fù)線粒體功能改善(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)病變[1-3]。二氫姜黃素(dihydrocurcumin，DHC)是姜黃素代謝得到的產(chǎn)物之一。關(guān)于DHC的藥理學(xué)活性研究還較少，可能具有改善NASH動(dòng)物肝臟脂肪沉積和胰島素抵抗作用，還可能有抗氧化和抗炎作用。 本研究觀察了DHC對(duì)棕櫚酸(palmitic acid，PA)體外誘導(dǎo)的正常大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A細(xì)胞脂肪變的影響，了解其在改善線粒體介導(dǎo)的凋亡通路方面的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品、試劑與儀器 正常大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存。DHC單體(上海源葉生物公司，純度≥98%)；PA和MTT(Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(四季清生物公司)；胰酶(吉諾生物公司)；檢測(cè)LDH試劑盒(南京建成生物公司)；檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9試劑盒、RIPA裂解液、SDS上樣緩沖液和化學(xué)發(fā)光液(碧云天生物公司)；檢測(cè)Annexin V-PI凋亡試劑盒(KeyGen公司)；抗β-actin、抗Bcl-2和抗Bax(Santa生物公司)；BCA試劑盒(Thermo公司)；Cocktail(Roche生物公司)。XDS-1B倒置相差顯微鏡(佳源興業(yè)科技有限公司)；iMARKTM酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；-80℃超低溫冰箱(海爾電器有限公司)；超凈工作臺(tái)(安泰空氣技術(shù)有限公司)；HEAR Cell CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司)；電泳儀、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(六一儀器廠)；Imager2000凝膠成像分析儀(Alpha Innotech公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 取BRL-3A細(xì)胞，接種于6孔板，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)。設(shè)對(duì)照組，用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組，用0.25 mM PA培養(yǎng)24 h和DHC處理組，先用0.25 mM PA培養(yǎng)24 h，再換成含16、32和64 μM DHC的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞按每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入0.25 mM PA培養(yǎng)24 h。然后，分別加入0、2、4、8、16、32、64和128 μM的DHC處理24 h。處理完成后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl 和PBS 180μl，于37℃反應(yīng)4 h，再每孔加入DMSO 150 μl，震蕩6 min，檢測(cè)570 nm處的吸光值。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH含量檢測(cè) 取細(xì)胞1×105個(gè)，接種于6孔板。如上處理，每孔吸取上清液20μl，按試劑說(shuō)明書操作，檢測(cè)490 nm處吸光值。收集孔中細(xì)胞并裂解，檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算每mg蛋白中LDH 含量。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 接種細(xì)胞1×105個(gè)于6孔板，同上處理后，消化并收集細(xì)胞。按Annexin V-PI凋亡試劑盒說(shuō)明行染色和沖洗，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)壞死、早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 取細(xì)胞1×105個(gè)，接種于6孔板，處理完成后用PBS洗滌，每孔加入5 μg/ml 的熒光染料JC-1 1 ml，37℃反應(yīng)20 min，分別檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)525 nm/發(fā)射波長(zhǎng)590 nm處和激發(fā)波長(zhǎng)490 nm/發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度，其比值即為樣本的線粒體膜電位。

1.7 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活性檢測(cè) 取細(xì)胞1×105個(gè)，接種于6孔板，處理完成后消化并收集細(xì)胞，檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算每mg蛋白中Caspase-3和Caspase-9的相對(duì)活性。

1.8 細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)，取細(xì)胞1×105個(gè)，接種于6孔板，處理完成后消化并收集細(xì)胞，用含有Cocktail和PMSF的RIPA裂解液在冰上處理細(xì)胞30 min，將得到的液體在12000 g離心10 min，取上清，獲得所需的蛋白液。按50 μg，分裝，并100℃變性10 min。用SDS-PAGE膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h，分別與特異性的一抗和二抗各孵育1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光液顯色，用成像儀分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較 0.25 mM PA及2、4、8、16、32和64 μM的DHC處理BRL-3A細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響，但128 μM的DHC處理細(xì)胞24 h能顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞存活率約為模型組的78%(P<0.05)。因此，我們選擇16、32和64 μM的DHC進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組細(xì)胞上清液生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組LDH水平、胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活性顯著升高(P<0.01)，線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，32μM DHC處理組和64μM DHC處理組LDH水平、胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9活性明顯降低(P<0.05)，線粒體膜電位明顯升高(P<0.05，表1)。

表1 DHC和PA處理的細(xì)胞上清液生化指標(biāo)比較

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組比，模型組凋亡細(xì)胞率明顯增加；與模型組比，PA處理組凋亡細(xì)胞率明顯降低(圖1)

圖1 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量比較 與對(duì)照組比，模型組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比，32μM DHC處理組和64μM DHC處理組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)，Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05，表2和圖2)。

表2 各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 各組BRL-3A細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量比較

3 討論

關(guān)于NASH的流行病學(xué)研究表明，NASH患者的發(fā)病率逐年在增加，在未來(lái)十年可能成為肝移植的主要原因。因此，關(guān)于NASH的防治研究已成為研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡與有絲分裂的過(guò)程在正常情況下處于平衡狀態(tài)，維持機(jī)體細(xì)胞的平衡。但在NASH模型中凋亡占主導(dǎo)地位，凋亡過(guò)度會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致肝損傷和氧化應(yīng)激紊亂等。因此，能否改善肝細(xì)胞的凋亡對(duì)于NASH的治療具有重要意義。用脂肪酸刺激肝細(xì)胞建立NASH的體外模型較為成熟，為研究藥物對(duì)NASH的作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

在PA誘導(dǎo)的BRL-3A細(xì)胞，我們首先觀察到DHC對(duì)PA引起細(xì)胞LDH的釋放有緩解作用。LDH一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞膜受損的時(shí)候會(huì)被釋放到培養(yǎng)上清，因此培養(yǎng)上清LDH越多，代表細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重[11]。我們的結(jié)果顯示DHC可以減少細(xì)胞LDH的釋放，說(shuō)明DHC可以改善PA引起的細(xì)胞膜的損傷。然后，我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了凋亡細(xì)胞情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHC可以減少由PA引起的細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死數(shù)量。通過(guò)這部分的研究結(jié)果，我們推測(cè)DHC可以改善脂肪變情況下的細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，線粒體介導(dǎo)的通路是非常重要的機(jī)制之一。線粒體凋亡途徑的激活主要與過(guò)多的ROS以及氧化損傷相關(guān)，它們會(huì)破壞線粒體膜的通透性，妨礙線粒體呼吸鏈的功能，形成凋亡復(fù)合物，活化凋亡效應(yīng)蛋白，加劇肝細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致肝損傷。而NASH與線粒體功能紊亂也關(guān)系十分密切。因此，我們推測(cè)DHC是否可以通過(guò)改善NASH模型線粒體介導(dǎo)的凋亡通路來(lái)減少細(xì)胞凋亡。

為了驗(yàn)證我們的猜想，我們首先檢測(cè)了細(xì)胞線粒體膜電位的改變，結(jié)果顯示PA會(huì)顯著降低細(xì)胞線粒體的膜電位，DHC可以恢復(fù)線粒體的膜電位。線粒體的膜電位被消除，是線粒體介導(dǎo)的凋亡通路被激活的標(biāo)志，它會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜之間的一些通道開放，引發(fā)后續(xù)凋亡事件的發(fā)生[14, 15]。這部分結(jié)果說(shuō)明PA確實(shí)會(huì)激活線粒體的凋亡通路，而DHC可以抑制該通路。

Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過(guò)保持線粒體膜的完整性來(lái)對(duì)抗凋亡[16]。Bax是促凋亡蛋白，可以形成Bax孔道，破壞線粒體外膜的通透性，使凋亡因子釋放出來(lái)[17]。Caspase-3和Caspase-9是線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中的效應(yīng)蛋白分子，它們一旦發(fā)生活化，會(huì)引起細(xì)胞DNA的斷裂、細(xì)胞核膜的裂解、核內(nèi)染色質(zhì)凝聚等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18, 19]。我們檢測(cè)了PA和DHC對(duì)這兩個(gè)酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA會(huì)顯著性地增加這兩個(gè)效應(yīng)酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，而DHC可以降低這兩個(gè)酶的活性，抑制細(xì)胞凋亡。