王征帆 萬曾培 高小鵬

摘要：CpG ODN是人工合成的具有非特異性免疫刺激的DNA序列，模擬細菌DNA在體內(nèi)的應(yīng)答過程，誘發(fā)細胞和體液免疫。CpG ODN作為新型免疫增強劑在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用展現(xiàn)出了巨大的潛力，并在免疫學(xué)、藥物學(xué)和藥效學(xué)等領(lǐng)域備受關(guān)注。然而CpG ODN并不穩(wěn)定且易被核酸酶酶解，其自身帶負電荷，不易結(jié)合到細胞表面。因此，CpG ODN如何高效傳遞并能有效攝取成了新的挑戰(zhàn)。納米傳遞系統(tǒng)的研究使CpG ODN單獨或協(xié)同疫苗免疫取得顯著療效，為改善CpG ODN在疫苗研究中的應(yīng)用拓寬了思路。從CpG ODN納米佐劑的作用機制、免疫活性、安全性及臨床應(yīng)用等方面進行綜述，并對該領(lǐng)域未來的研究方向進行展望，為后續(xù)工作提供有益參考。

關(guān)鍵詞：CpG ODN;納米佐劑;作用機制;免疫活性;安全性

Abstract： CpG ODN is a synthetic DNA sequence with non-specific immunostimulation which simulates the response process of bacterial DNA in vivo， inducing cellular and humoral immunity. CpG ODN has shown great potential as a novel immunopotentiator in veterinary clinical applications， and has attracted much attention in the fields of immunology， pharmacology and pharmacodynamics. However， CpG ODN is unstable and easily digested by nucleases， which are negatively charged and do not easily bind to the cell surface. Therefore， how to efficiently transfer CpG ODN and effectively ingest it becomes a new challenge. The study of nano-transmission system has achieved significant efficacy for CpG ODN alone or in combination with vaccine immunization， and broadened the thinking for improving the application of CpG ODN in vaccine research. The mechanism of action， immunological activity， safety and clinical application of CpG ODN nanoadjuvant were summarized， and future research directions in this field was prospected， to provide useful reference for follow-up work.

Key words： CpG ODN; nano adjuvant; mechanism of action; immunological activity; safety

CpG ODN是人工合成的具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的DNA重復(fù)序列，能誘導(dǎo)強烈的細胞免疫和體液免疫，增強機體免疫應(yīng)答。CpG ODN的早期研究源于對癌癥的治療，Tokunag等[1]通過對牛減毒分枝桿菌提取結(jié)核素（Mycobacterium，BCG），研究證實了細菌DNA具有抗腫瘤和提高NK活性的功能，能夠誘導(dǎo)Ⅰ、Ⅱ型干擾素的產(chǎn)生。之后的研究發(fā)現(xiàn)非甲基化的CpG DNA（即CpG基序）也具有免疫刺激作用[2]。大量的研究表明，CpG ODN能夠增強多種免疫細胞的成熟、分化和增殖，誘導(dǎo)其分泌多種細胞因子和趨化因子[3，4]。游離的CpG ODN不易粘附細胞、極易被核酸酶酶解，因而使CpG ODN的免疫增強效應(yīng)大打折扣。納米傳遞系統(tǒng)為CpG ODN的高效傳遞和攝取提供了通道，增強了CpG ODN對機體的細胞免疫，進而提高機體的免疫應(yīng)答。目前CpG ODN納米佐劑在病毒、細菌和腫瘤等疾病研究方面效果顯著，并在臨床上得到初步應(yīng)用。

1 CpG ODN

皮膚和黏膜是機體的第一道防線，黏膜免疫系統(tǒng)為機體提供了最初的免疫保護。CpG ODN是一種新型的高效低毒、具有促進Th1免疫應(yīng)答特點的疫苗佐劑，能夠顯著提高疫苗的免疫原性且有較好的安全性，在黏膜免疫中預(yù)防和治療由病毒、細菌、腫瘤等諸多因素引起的疾病中取得了顯著成效。非甲基化CpG DNA廣泛存在于原核生物如細菌基因組中，人和脊椎動物的CpG DNA絕大多數(shù)被甲基化，只有非甲基化的CpG DNA具有免疫刺激效應(yīng)。然而不同的CpG DNA作用于不同物種引起的免疫刺激效應(yīng)有所差異，CpG DNA具有種屬特異性，如體外試驗發(fā)現(xiàn)對小鼠和兔具有最佳免疫刺激序列的CpG基序是GACGTT，對人和其他脊椎動物具有最佳免疫刺激效應(yīng)的CpG基序為GTCGTT，同時CpG ODN的ISS、回文結(jié)構(gòu)等都對其活性有顯著影響[5]。CpG ODN作為一種“危險信號”，被機體內(nèi)toll樣受體9（TLR-9）識別并特異性結(jié)合，引發(fā)免疫調(diào)節(jié)來增強機體清除病原體的能力[6，7]。有關(guān)研究表明CpG ODN可能通過兩條途徑即K基因結(jié)合核因子（NF-κB）和激活蛋白-1等發(fā)揮免疫效應(yīng)，如CpG ODN納米遞送系統(tǒng)明顯提高了CpG ODN的粘附能力和內(nèi)化作用，促使CpG ODN對NF-κB活性的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)促炎細胞因子（包括IL-12、IL-6和TNF-α）的顯著增加[8，9]。TLR-9與MyD88作用激活TRAF6、TRAF6與轉(zhuǎn)化生長因子β相關(guān)酶1結(jié)合蛋白 TAB1與TAB2作用，激活下游NF-κB與AP-1[10]。CpG ODN是人工合成的具有免疫刺激效應(yīng)的CpG基序，同時具有穩(wěn)定、低成本、易合成、高效低毒等的優(yōu)點[11]，已經(jīng)開始應(yīng)用于人醫(yī)和獸醫(yī)臨床。

2 CpG ODN納米佐劑的作用機理

CpG ODN模擬細菌在體內(nèi)的免疫過程是TLR-9的特異性配體。CpG ODN為非甲基化的DNA序列，在體內(nèi)并不穩(wěn)定，而納米遞送系統(tǒng)能顯著提高CpG ODN在機體內(nèi)的傳遞效率、靶向效應(yīng)和免疫刺激能力[12]。目前CpG ODN納米遞送系統(tǒng)主要有：無機納米材料的輸送系統(tǒng)如BNNS-based運載系統(tǒng)、基于碳納米材料的傳遞系統(tǒng)及金納米顆粒為基礎(chǔ)的傳遞系統(tǒng);基于脂質(zhì)/聚合物的輸送系統(tǒng)和自組裝基于DNA結(jié)構(gòu)的遞送系統(tǒng)[13]。納米遞送系統(tǒng)的研究為新型免疫增強劑的研發(fā)開辟了新途徑，在病毒性疾病、細菌性疾病及腫瘤性疾病等方面體現(xiàn)出極高的應(yīng)用價值。

納米材料為陽性高分子，對細胞膜具有強烈的粘附作用。納米材料結(jié)合CpG ODN免受酸、核酸酶及肝臟的首過效應(yīng)，極易粘附并被細胞內(nèi)化，促進了其在細胞內(nèi)的富集，增強了與TLR-9的結(jié)合能力[14]。CpG ODN納米佐劑在機體內(nèi)發(fā)揮免疫效應(yīng)具有嚴謹?shù)淖饔脵C理。CpG ODN的半衰期很短，嚴重限制了其在體內(nèi)的局部免疫作用，納米佐劑延長了CpG ODN的半衰期，使其在局部效應(yīng)更持久，如脂質(zhì)體CpG-DNA誘導(dǎo)了OVA特異性的Th1偏向免疫，延長半衰期并增強細胞毒性記憶T細胞分化，明顯減慢腫瘤的生長[15];CpG ODN通過粘附細胞膜，進入細胞并激活溶酶體上的TLR-9，相對于游離的CpG ODN，CpG ODN納米佐劑顯著增強了細胞攝取的能力和效率[16]。然而細胞內(nèi)的CpG ODN很難保證準確遞送并激活TLR-9受體，因此利用核內(nèi)受體阻斷劑提高CpG ODN與TLR-9的結(jié)合能力，增強其免疫效應(yīng)。CpG ODN也是TLR-9的激動劑，TLR-9的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)是CpG ODN發(fā)揮免疫效應(yīng)的有效途徑，通過增加細胞內(nèi)溶酶體上的TLR-9來增強機體免疫。Ebrahimian等[17]研究發(fā)現(xiàn)CpG ODN納米傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生了平衡的Th1和Th2免疫反應(yīng)，且更偏向于Th1反應(yīng)。CpG ODN納米佐劑延遲了CpG ODN的半衰期，提高了細胞的內(nèi)化作用和在溶酶體上的緩釋能力，減少了CpG ODN的丟失并增強了免疫效應(yīng)。

3 CpG ODN納米佐劑的免疫活性及安全性

CpG ODN納米佐劑具有較游離CpG ODN更強的免疫增效作用，其安全性問題備受關(guān)注。納米傳遞系統(tǒng)增強CpG ODN的粘附性、細胞內(nèi)化和免疫反應(yīng)的同時，有可能產(chǎn)生局部的自身免疫原性或?qū)е滤拗鞯膽?yīng)激能力增強。目前有很多評估CpG ODN納米佐劑的免疫活性和安全性研究，大多數(shù)研究表明，CpG ODN納米佐劑在免疫治療方面有較游離CpG ODN更好的治療作用，尚未發(fā)現(xiàn)其副作用。如金納米顆粒有效刺激免疫細胞釋放促炎因子，顯著延遲了腫瘤的生長并延長了荷瘤小鼠的存活[18];脂質(zhì)體CpG DNA較游離CpG DNA溶液更容易傳遞到TLR-9表達的DC中，促進了DC產(chǎn)生細胞因子和共刺激分子，并誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出強大的抗腫瘤作用[19];內(nèi)溶酶CpG ODN納米顆粒方法簡單、方便且有效，增強細胞反應(yīng)并且未顯示出明顯的毒性[20];殼聚糖CpG ODN納米顆粒（NPs）能夠激發(fā)細胞介導(dǎo)的細胞和黏膜免疫，而對HTLV-1沒有炎癥反應(yīng)[21]，并且在體外試驗中濃度比游離CpG ODN低99.9%的情況下對細胞仍有免疫效應(yīng)，且毒性更小[22]。CpG ODN納米佐劑是一種預(yù)防和治療多種疾病的希望佐劑，仍需長期而深入的臨床研究。

4 CpG ODN納米佐劑的臨床應(yīng)用

4.1 病毒性疾病

CpG ODN納米佐劑已經(jīng)開始應(yīng)用于病毒疫苗新型佐劑的研究，并取得了突破性進展。據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN納米傳遞系統(tǒng)增強REV亞單位疫苗抗病毒作用[23]，促進細胞免疫對HBsAg的應(yīng)答并誘導(dǎo)更高水平的特異性抗體滴度[24]。CpG ODN納米佐劑為機體黏膜免疫提供了強大助力，增強了機體抵抗力，最終提高了機體的免疫保護功能。如CpG ODN納米佐劑經(jīng)鼻黏膜免疫增強感染A型流感疫苗的免疫活性[25]，產(chǎn)生較高的黏膜抗體和細胞免疫應(yīng)答[26]。納米傳遞系統(tǒng)為CpG ODN的免疫刺激提供了捷徑，為CpG ODN納米佐劑應(yīng)對暴發(fā)重大動物病毒性疾病的緊急預(yù)防和治療提供了廣闊的前景。

4.2 細菌性疾病

機體面對周圍數(shù)以萬計的細菌威脅，免疫系統(tǒng)勢單力薄，先天性免疫缺乏特異性，獲得性免疫后勁不足。CpG ODN被譽為“基因治療”藥物，備受研究界關(guān)注。研究表明，CpG ODN納米佐劑比游離CpG ODN更具優(yōu)勢，有較高的遞送效率和免疫效應(yīng)。如CpG ODN納米佐劑誘導(dǎo)細胞因子和抗菌肽的表達，減少人類彎曲桿菌病發(fā)病率[27]，增強體液免疫預(yù)防金黃色葡萄球菌引起的牛乳腺炎[28]，促進雙歧桿菌的生長并提高上皮細胞和免疫細胞共培養(yǎng)模型中IFN-?、IL-10等的濃度[29]，從而增強機體抵抗力。可見CpG ODN納米佐劑對細菌引起的疾病具有較明顯的治療效果。

4.3 腫瘤性疾病

CpG ODN作為新型免疫增效劑被認為是治療腫瘤性疾病的希望疫苗佐劑。通過對CpG ODN的單獨或聯(lián)合免疫治療腫瘤以誘發(fā)保護性免疫反應(yīng)試驗，發(fā)現(xiàn)CpG ODN有良好的抗腫瘤作用，但其自身易受環(huán)境因素的影響。CpG ODN納米佐劑在治療腫瘤性疾病較游離的CpG ODN效果更明顯，其治療腫瘤的特點主要有2個方面。①細胞攝取和胞漿定位。如CpG ODN納米佐劑的藥物靶向性提高了腫瘤（TME）的治療效果[30]，其粒徑優(yōu)勢，幾乎完全阻止了E.G7-OVA腫瘤的生長[31]，增加腫瘤細胞疫苗的細胞攝取和胞漿定位，更大程度地激活機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，增加抗腫瘤免疫效應(yīng)[32]。②有效遞送和延長半衰期。如CpG ODN納米佐劑比游離CpG ODN在腫瘤和引流淋巴結(jié)中的保留時間更長[33]，增強了CpG ODN對免疫細胞的傳遞和啟動抗腫瘤免疫反應(yīng)[34，35]，能顯著抑制腫瘤的生長，可作為治療和預(yù)防HER2 +乳腺癌的候選疫苗[36]。

CpG ODN納米佐劑的應(yīng)用除了以上發(fā)現(xiàn)外，在其他領(lǐng)域也開始被研究，如寄生蟲感染、過敏性疾病、損傷性心臟功能紊亂、老年病等的治療[17，37，38]。隨著人們對CpG ODN納米佐劑的探索和認識的不斷深入，CpG ODN納米佐劑在臨床上將體現(xiàn)更高的應(yīng)用價值。

5 小結(jié)與展望

CpG ODN作為一種新型的高效低毒免疫增效劑，在病毒、細菌及腫瘤等方面的研究取得了突破性進展，但其在體內(nèi)極易受影響而限制了其局部免疫反應(yīng);納米粒傳遞系統(tǒng)的研究使CpG ODN在吸附、內(nèi)吞、遞送等過程得到優(yōu)化，增強了CpG ODN的免疫原性，并且更安全、更經(jīng)濟[39]。目前CpG ODN納米佐劑的臨床試驗正在積極地進行，但仍然存在一些問題，如CpG ODN存在明顯的種屬特異性，最佳免疫劑量和安全性不明確，最佳給藥途徑的選擇以及在體內(nèi)如何釋放、限于局部免疫[40]等。CpG ODN納米佐劑的研究目前仍處于初步階段，在未來的高效低毒新型疫苗增強劑的研究與開發(fā)中定能大放異彩。

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