高輝， 齊月， 高雨

1中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科(遼寧沈陽 110015)； 2中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院婦產(chǎn)科(遼寧沈陽 110042)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是全球女性死亡的主要原因。在亞洲，宮頸癌是僅次于乳腺癌的女性最致命的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年宮頸癌約有52.76萬名新確診病例，當(dāng)年死亡病例26.57萬例[2]。低收入和中等收入國(guó)家的女性具有更高的患病率[2-3]。其中，持續(xù)高危人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌的一個(gè)主要致病因素，約超過95%的宮頸癌患者是HPV陽性[4]。從HPV感染、宮頸上皮內(nèi)瘤變、原位癌到浸潤(rùn)癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，宮頸癌發(fā)病過程復(fù)雜，伴多步驟、多基因調(diào)控異常。而這一過程往往涉及到多種編碼和非編碼基因的表達(dá)失調(diào)[5-7]。雖然綜合治療提高了宮頸癌的臨床治療效果，但晚期宮頸癌的預(yù)后仍有待提高。因此，有必要探討宮頸癌相關(guān)的功能分子和治療靶點(diǎn)[8]。2002年，Okazaki等[9]在對(duì)小鼠全長(zhǎng)互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)文庫(kù)的大規(guī)模測(cè)序中，首次發(fā)現(xiàn)了一種新型的轉(zhuǎn)錄本，即長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)。lncRNA是一種長(zhǎng)度超過200 nt的功能性RNA分子，由于缺少開放的閱讀框，lncRNA幾乎失去了對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的能力[10-11]。但是，lncRNA可以以RNA的形式在不同水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[12]：lncRNAs作為“腳手架”介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用[10,13]；作為“引導(dǎo)員”，它們促進(jìn)蛋白質(zhì)和基因的啟動(dòng)子結(jié)合；作為“信號(hào)”它們調(diào)節(jié)鄰近基因的轉(zhuǎn)錄；作為“誘餌”，它們與miRNA或蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄[14]。因此，它在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和死亡中起著關(guān)鍵作用[15]。而且越來越多的證據(jù)表明，lncRNA參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展：lncRNA-CTS通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA機(jī)制調(diào)控ZEB2，影響宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]；lncRNA-CCDST作為“腳手架”促進(jìn)MDM2和DHX9的互作，誘導(dǎo)宮頸癌的血管新生和侵襲轉(zhuǎn)移[17]。本研究中，我們應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)lncRNA tumor suppressor candidate 8 (lncRNA TUSC8)在宮頸癌癌組織和癌旁組織以及其在宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并分析其與宮頸癌臨床病理數(shù)據(jù)的相關(guān)性，為宮頸癌預(yù)后評(píng)估提供新的潛在分子標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 本研究方案經(jīng)醫(yī)院道德與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，選取2009年2月至2015年2月于本院就診患者的病理組織，共計(jì)120例，患者對(duì)研究均知情，并簽署知情同意書。入組患者在我院確診為宮頸癌并行根治性切除術(shù)，臨床分期依據(jù)按照 2009 年FIGO宮頸癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，所有患者腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織新鮮取材，癌旁組織距腫瘤邊緣5 cm以上，避免明顯鈣化或壞死部分；標(biāo)本獲取后放入凍存管并立即保存于液氮中，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。所有患者均未接受術(shù)前放化療，且無其他腫瘤病史及器官重大疾病史。電話隨訪(最長(zhǎng)隨訪時(shí)間122個(gè)月，失訪5例)記錄預(yù)后生存資料無病生存時(shí)間(disease-free survival, DFS)、總生存時(shí)間(overall survivl, OS)：TNM分期，Ⅰ期73例，Ⅱ期47例。自患者術(shù)后半年開始隨訪，隨訪終點(diǎn)時(shí)間為死亡或本研究截止日2020年1月31日(表1)。

1.2 細(xì)胞株 宮頸癌細(xì)胞系(SiHa、HeLa、CaSki、C-33A)和正常宮頸細(xì)胞株Ect1/E6E7均取自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。于DMEM培養(yǎng)基中添加1%青、鏈霉素雙抗體和10%胎牛血清，常規(guī)置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每隔2～3 d傳代1次，直到細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 RT-PCR TRIzol法提取病理標(biāo)本和細(xì)胞中的總RNA，并檢測(cè)RNA的純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)均嚴(yán)格按照TAKARA公司說明書進(jìn)行，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在ROCHE實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀上對(duì)lncRNA TUSC8在細(xì)胞及組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

lncRNA TUSC8的上游引物序列為5′-GTTCTTGTGTCTGGATAGGA-3′，下游引物序列為5′-TGCTTGCTACTTGACTTGA-3′；U6的上游引物序列為5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′，下游引物序列為5′-CACTATTGCGGGCTGC-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算兩者的相對(duì)表達(dá)量。ΔCt=CtlncRNA TUSC8-CtU6。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA TUSC8在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果顯示，lncRNA TUSC8在宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HeLa、CaSki、C-33A中的表達(dá)水平分別為0.35±0.09 、0.41±0.10、0.41±0.11、0.47 ±0.09較正常宮頸細(xì)胞株Ect1/E6E7中的lncRNA TUSC81的表達(dá)水平1.00±0.16明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1-A。lncRNA TUSC8在宮頸癌組織中的表達(dá)量為0.47±0.17，而在癌旁組織中表達(dá)為1.00±0.58，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1-B。

注：A: lncRNA TUSC81細(xì)胞中表達(dá)差異；B: lncRNA TUSC81在癌組織和癌旁組織中表達(dá)差異

2.2 lncRNA TUSC8的表達(dá)水平CC患者臨床病理特征關(guān)系 lncRNA TUSC8在CC組織中的表達(dá)中位數(shù)為0.47，將表達(dá)水平高于0.47的患者歸為lncRNA TUSC8高表達(dá)組,共包括58例患者(48.3%)，將表達(dá)水平低于0.47的患者作為lncRNA TUSC8低表達(dá)組,共包括患者62例(51.7%)。單因素ANOVA分析lncRNA TUSC8表達(dá)與CC臨床病理特征的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示lncRNA TUSC8的表達(dá)水平與CC的組織學(xué)來源、腫瘤分化程度和TNM分期密切相關(guān)(P<0.05)。lncRNA TUSC8表達(dá)與其他臨床病理特征(年齡、HPV、腫瘤大小)不相關(guān)(P>0.05)。見表2。

表1 患者特征和單變量分析(n=120)

2.3 lncRNA TUSC8的表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后相關(guān)性 本研究共隨訪120例患者，術(shù)后5年內(nèi)死亡病例22例(死亡率18.3%)，中位DFS 52個(gè)月，中位OS 91.09個(gè)月。lncRNA TUSC8高表達(dá)組患者58例，中位DFS 76.64個(gè)月，中位OS 63.24個(gè)月；lncRNA TUSC8低表達(dá)組患者62例，中位DFS 56.85個(gè)月，中位OS 74.18個(gè)月；兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。Kaplan-Meier生存曲線顯示lncRNA TUSC8表達(dá)水平越低，患者的DFS越短(2=5.09，P=0.02)，見圖2-A，OS越短(2=5.07，P=0.02)，見圖2-B，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)lncRNA TUSC8表達(dá)與CC患者DFS、OS密切相關(guān)，HR分別為-2.99(0.46～0.93)、-2.87(0.47～0.98)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)，提示lncRNA TUSC8的低表達(dá)有可能作為宮頸癌的預(yù)后判斷指標(biāo)。

3 討論

宮頸癌是全球范圍內(nèi)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康。目前對(duì)于宮頸癌的研究已逐步細(xì)化，從細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平[18]。大量研究報(bào)道，lncRNAs可通過與蛋白結(jié)合或通過調(diào)控miRNA表達(dá)，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。部分研究也強(qiáng)調(diào)了lncRNAs的致癌特性以及其在宮頸癌惡性表型中的貢獻(xiàn)：lncRNA PCAT6通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA機(jī)制調(diào)控ZEB1，影響宮頸癌細(xì)胞的化療耐藥[19]；LINC00511與轉(zhuǎn)錄因子RXRA協(xié)同作用調(diào)節(jié)PLD1的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的自噬和凋亡[20]；而lncRNA-ANRIL、lncRNA-CCHE1和MEG3可能與宮頸癌細(xì)胞的異常增殖和逃避凋亡密切相關(guān)[21-23]。

表2 lncRNA TUSC8表達(dá)與臨床病理特征 例(%)

lncRNA TUSC8與宮頸癌的相關(guān)性由Zhu等[24]首先報(bào)道，研究指出lncRNA TUSC8在宮頸癌細(xì)胞和組織中表達(dá)降低，它可與PTEN競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-641，從而影響PTEN基因的表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。隨后，Zhao 等[25]也發(fā)現(xiàn)lncRNA TUSC8在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)也明顯減低，同樣地它也可以通過內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制影響miRNA-190b-5p以及MYLIP的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。雖然目前關(guān)于lncRNA TUSC8的分子機(jī)制尚沒有進(jìn)一步的深入研究，但其在兩種女性高發(fā)腫瘤中存在特異性低表達(dá)，仍值得臨床和科研工作者密切關(guān)注，其表達(dá)是否與雌激素、X染色體等相關(guān)，需進(jìn)一步探討。

目前為止，lncRNA TUSC8在宮頸癌中的臨床意義研究仍是空白?；诖耍狙芯繉?duì)本中心120例宮頸癌患者的臨床資料和病理標(biāo)本進(jìn)行了回顧性研究，結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)同正常宮頸細(xì)胞和癌旁組織相比，lncRNA TUSC8在癌細(xì)胞和組織中均低表達(dá)?；仡櫯R床病理資料，lncRNA TUSC8的表達(dá)同腫瘤組織分類、分化程度和TNM分期密切相關(guān)。單因素和多因素生存分析顯示，lncRNA TUSC8是宮頸癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究的結(jié)果證實(shí)lncRNA TUSC8可作為判斷宮頸癌患者生存及預(yù)后的分子標(biāo)志物，進(jìn)一步闡釋了lncRNA TUSC8的功能和臨床意義，有助于宮頸癌患者的治療。但是本研究也有一定的不足：首先，我們納入的均為手術(shù)患者，直接導(dǎo)致分期納入不全，僅有FIGO Ⅰ～Ⅱ期患者納入研究；其次，為了保證均質(zhì)比較，經(jīng)過放化療治療的患者也并沒有納入研究；最后，本研究納入的為單中心數(shù)據(jù)，研究結(jié)論有待大宗數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。

注：A：DFS；B：OS

表3 宮頸癌患者預(yù)后因素多元分析

綜上所述，本研究結(jié)果提示lncRNA TUSC8在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但結(jié)果仍需進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。關(guān)于lncRNA TUSC8表達(dá)變化同宮頸癌惡性表型的關(guān)系及其具體調(diào)控機(jī)制仍需我們通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步闡述。