蔡燕飛， 陳 蘊(yùn)， 史勁松， 金 堅(jiān)

（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122）

0 引 言

近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法的不斷更新與發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)已經(jīng)滲透到免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)等生命科學(xué)的多個(gè)分支學(xué)科，并逐漸成為現(xiàn)代生命科學(xué)中的一門重要的基礎(chǔ)前沿學(xué)科［1-2］。因此，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程體系的改革和建設(shè)是提高細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。

在例如細(xì)胞生物學(xué)這類基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，傳統(tǒng)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)教學(xué)已顯現(xiàn)出諸多弊端，嚴(yán)重地影響了對(duì)學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)素質(zhì)的培養(yǎng)。傳統(tǒng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)采取單一、填鴨式的教學(xué)方式，且僅傳授給學(xué)生一些基本的實(shí)驗(yàn)技能和方法，在培養(yǎng)學(xué)生的綜合研究能力方面很少下工夫［3-5］。錢偉長先生曾說，“大學(xué)必須拆除教學(xué)與科研之間的高墻；教學(xué)沒有科研做底蘊(yùn)，就是一種沒有觀點(diǎn)的教育，沒有靈魂的教育”。因此通過教研結(jié)合，將科研內(nèi)容引入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，促進(jìn)科研與教學(xué)的有機(jī)結(jié)合，這樣不僅可以增加學(xué)生對(duì)科研知識(shí)的學(xué)習(xí)興趣，同時(shí)也有利于理論知識(shí)的鞏固，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力意義重大。同時(shí)，也可以將教學(xué)過程中獲得的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化到科研成果中，幫助快速推進(jìn)科研項(xiàng)目進(jìn)展，兩者相互促進(jìn)相互補(bǔ)充，一舉多得［6-8］。

為此，結(jié)合科研團(tuán)隊(duì)的前期研究成果，設(shè)計(jì)了以“抗腫瘤藥物的體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)”為主題的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。以經(jīng)典的廣譜抗腫瘤藥物阿霉素（Adrimycin，ADM）作為受試藥物，通過MTT 法檢測ADM對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、黑色素瘤B16 細(xì)胞、肺癌A549 細(xì)胞、卵巢癌A2780 細(xì)胞和肝癌Bel7402 細(xì)胞的半數(shù)致死劑量，并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測ADM 對(duì)各種細(xì)胞的促凋亡能力，從而研究ADM 的抗腫瘤效果［9-13］。通過MTT 染色法測細(xì)胞活性是細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟都是常規(guī)的，但是單一的實(shí)驗(yàn)方法并不具備一定的創(chuàng)新性，如果通過教研結(jié)合，運(yùn)用通用的實(shí)驗(yàn)方法來解決一定的科研問題，如通過MTT法對(duì)化療藥物阿霉素進(jìn)行體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)，通過檢測多種腫瘤細(xì)胞對(duì)ADM 的藥物敏感性，從而探討ADM的抗腫瘤效果，那么開展該綜合性實(shí)驗(yàn)的意義就大不相同了。同時(shí)引入先進(jìn)的流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證ADM 的抗腫瘤效果的同時(shí)，也激發(fā)了學(xué)生對(duì)于科研的探索和熱情，有助于學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ奶嵘?/p>

學(xué)生按照2 或3 人1 組，通過自行查閱文獻(xiàn)，確定藥物作用濃度，設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)前期老師與學(xué)生開展一次討論會(huì)，評(píng)估各組實(shí)驗(yàn)方案的科學(xué)性和可行性，并最終確定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，教師收集各組學(xué)生的統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后將所有數(shù)據(jù)發(fā)給每組學(xué)生，各組將全班數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并最后得出結(jié)論，提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告，最后以PPT 的形式分享實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)心得，并對(duì)該課程進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮?/h2>

抗腫瘤藥物的體外藥效學(xué)研究，就是利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，根據(jù)不同原理測定藥物的抗腫瘤作用，例如通過腫瘤細(xì)胞活性檢測、凋亡相關(guān)蛋白酶活性檢測、亞細(xì)胞形態(tài)改變等途徑鑒定藥物的抗腫瘤效果。本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)典的MTT染色法檢測5 種不同來源的實(shí)體瘤細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，包括乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、黑色素瘤B16 細(xì)胞、肺癌A549 細(xì)胞、胃癌A2780 細(xì)胞和肝癌Bel7402 細(xì)胞，并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測ADM 對(duì)各種細(xì)胞的促凋亡能力，從而研究ADM 的抗腫瘤效果［14-15］。

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。MTT溶解液能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，MTT染色法是最經(jīng)典的用于檢測體外細(xì)胞活性的方法。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。將Annexin V進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，通過流式細(xì)胞技術(shù)就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來［16-17］。

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 細(xì)胞株

乳腺癌MCF-7 細(xì)胞、黑色素瘤B16 細(xì)胞、肺癌A549 細(xì)胞、卵巢癌A2780 細(xì)胞和肝癌細(xì)胞Bel7402 均來自江南大學(xué)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)室，原始細(xì)胞均購自中科院上海細(xì)胞庫。

2.2 主要試劑

胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)液均購自Gibco 公司；PBS、青霉素鏈霉素溶液和胰蛋白酶均購自Hyclone公司；臺(tái)盼藍(lán)染色液、MTT 染色液和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

5 種細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液中，其中MCF-7 細(xì)胞中需額外添加10 μg ／ mL的胰島素，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，0． 25%胰酶消化傳代。

3.2 MTT染色法測細(xì)胞活性

（1）細(xì)胞按照7 000 個(gè)／孔、每孔100 μL 鋪96孔板；

（2）培養(yǎng)過夜后，吸去上清液，按照設(shè)置的藥物濃度梯度加藥，每孔100 μL；

（3）藥物作用72 h后，每孔加10 μL 5 mg ／ mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；

（4）棄上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；

（5）用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定其光吸收值；

（6）根據(jù)吸光值計(jì)算細(xì)胞活率，運(yùn)用Prism軟件，以藥物濃度的lg值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算IC50 值。

3.3 Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測細(xì)胞凋亡

（1）藥物作用48 h后，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1． 0 ×106個(gè)細(xì)胞離心，棄上清。

（2）用提前預(yù)冷的PBS 清洗兩遍，棄上清，再加入1 mL 1 × Binding Buffer，細(xì)胞重懸。

（3）從上述懸液中取100 μL 細(xì)胞懸液加入1． 5 mL離心管，避光條件下，先加入5 μL FITC染料，再加入5 μL PI染料，常溫避光孵育15 min。

（4）加入400 μL 1 × Binding Buffer 進(jìn)行稀釋，在1 h內(nèi)將樣品在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測。

（5）運(yùn)用Flow J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Graph Pad Prism5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以ˉx ± s 表示，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 MTT染色法檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性

將一個(gè)自然班按照2 或3 人／組進(jìn)行分組，共15組，每3 組選擇一種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前期，學(xué)生自行調(diào)研文獻(xiàn)，制定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，在經(jīng)過與老師討論后確定最終的實(shí)驗(yàn)方案。在MTT實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生根據(jù)調(diào)研自行設(shè)計(jì)藥物作用濃度梯度，計(jì)算好稀釋方法。圖1 所示為其中一組的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明，隨著ADM藥物濃度的升高，人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的活率逐漸下降，該組藥物濃度設(shè)置較為合理，基本覆蓋了完全抑制到無抑制效果的全過程，擬合的曲線呈S型，經(jīng)計(jì)算ADM對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的IC50 為0． 15 μmol／ L。表1 所示為將15 組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，表明ADM具有明顯的廣譜抗腫瘤效果，對(duì)5 種不同的腫瘤細(xì)胞均具有一定的抑制作用，其中乳腺癌MCF-7 細(xì)胞對(duì)ADM 最為敏感，其IC50 值小于1． 0 μmol／ L，肝癌Bel7402 細(xì)胞對(duì)ADM最不敏感，其IC50值大于10 μmol／ L。

圖1 MTT法檢測人乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性

表1 5 種不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)ADM的藥敏性檢測（ˉx ± s，n ＝3）

4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測ADM的促凋亡能力

運(yùn)用Annexin V 聯(lián)合PI染色法檢測ADM的促凋亡能力。根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選擇3 μmol／ L濃度的ADM作用于各種腫瘤細(xì)胞，48 h 后檢測細(xì)胞的凋亡情況。圖2 所示為其中一組的流式圖，結(jié)果顯示3 μmol／ L 的ADM 作用于乳腺癌MCF-7 細(xì)胞48 h后，活細(xì)胞比例為0． 73%，壞死細(xì)胞比例為10． 1%，早期凋亡細(xì)胞比例為1． 72%，晚期細(xì)胞凋亡比例為87． 5%。將15 組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2 所示。結(jié)果顯示，3 μmol／ L 的ADM 使約90%的乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡，約50%左右的黑色素瘤B16 細(xì)胞和卵巢癌A2780 細(xì)胞發(fā)生凋亡，約20%左右的肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，肝癌Bel7402細(xì)胞幾乎不發(fā)生凋亡，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與藥敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了ADM具有廣譜的抗腫瘤藥效果，但是對(duì)于不同來源的腫瘤其抗腫瘤效果有所差異，對(duì)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞最為敏感，對(duì)肝癌Bel7402 細(xì)胞的敏感性較差。

圖2 ADM對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的促凋亡能力檢測

表2 ADM對(duì)5 種不同腫瘤細(xì)胞的促凋亡能力檢測（ˉx ± s，n ＝3）

5 結(jié) 語

通過經(jīng)典的MTT 染色法檢測5 種不同來源的實(shí)體瘤細(xì)胞對(duì)ADM 的敏感性，并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測ADM 對(duì)各種細(xì)胞的促凋亡能力，從而研究ADM的抗腫瘤效果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生通過文獻(xiàn)調(diào)研了解了抗腫瘤藥物抗腫瘤活性研究的基本方法和原理，通過細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡檢測，學(xué)生掌握了細(xì)胞培養(yǎng)的基本實(shí)驗(yàn)操作技能，熟悉了倒置顯微鏡、離心機(jī)等簡單儀器的使用方法，了解了酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等自動(dòng)化儀器的檢測方法，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析一系列連貫的鍛煉，學(xué)生的整體實(shí)驗(yàn)操作能力、分析問題和解決問題的能力、科研創(chuàng)新能力均有了很大提升。

從課程實(shí)施和學(xué)生反饋結(jié)果來看，仍有以下幾個(gè)方面可以持續(xù)改進(jìn)：①課程內(nèi)容需隨著科研進(jìn)展進(jìn)一步加深和完善。本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目應(yīng)與學(xué)科前沿的步調(diào)相一致，脫離科研的實(shí)驗(yàn)教學(xué)已無法達(dá)到現(xiàn)代人才培養(yǎng)的要求；②持續(xù)改進(jìn)教學(xué)方式。開放式教學(xué)是目前綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的新型教學(xué)模式，但其具體的方式方法還不夠成熟，還需要進(jìn)一步摸索和改進(jìn)；③實(shí)驗(yàn)設(shè)施不斷完善。及時(shí)更新?lián)Q代科學(xué)儀器設(shè)備，緊跟時(shí)代發(fā)展的步伐；④優(yōu)化師資結(jié)構(gòu)。當(dāng)代細(xì)胞生物學(xué)已滲透到多個(gè)分支學(xué)科，因此對(duì)于指導(dǎo)教師的專業(yè)要求也隨之改變，對(duì)于類似綜合性的實(shí)驗(yàn)課程，指導(dǎo)教師的專業(yè)要求需更加廣泛。