高偉東，馮贊杰，彭慈軍，張世龍，吳波，耿新

（1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，貴州 遵義 563000）

肝臟缺血再灌注損傷（hepatici schemia reperfusion injury，HIRI）是指肝臟在阻斷血流一段時間后恢復血液灌注不僅不能減輕肝臟損傷反而加重的現(xiàn)象，是肝臟外科面臨的重要臨床問題之一[1]。內皮細胞和Kupffer細胞腫脹，中性粒細胞浸潤，血管收縮是HIRI的特征性表現(xiàn)[2]。在肝臟手術中阻斷肝臟血流是不可避免的，由缺血再灌注導致的肝損傷是影響術后患者恢復，甚至導致死亡的重要因素[3-5]。預防HIRI是改善患者預后及提高患者生存率的重要策略。

近年來，藥用植物在防治HIRI的研究越來越多，許多藥用植物提取物和從中分離得到的單體成分被證實在HIRI中具有保護作用[6-7]。杜仲是中國的特有木本植物，現(xiàn)廣泛種植于中國中部及南部，杜仲作為藥用植物的歷史已有2 000多年，使用現(xiàn)代科技現(xiàn)已從杜仲中分離出204種天然化合物，共分為7個大類，這些化合物具有廣泛的藥理作用，例如抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)、降低血壓等[8-10]，而炎癥和氧化應激反應是促進HIRI發(fā)生發(fā)展的兩個重要因素。杜仲提取物在HIRI中是否具有保護作用，目前鮮有報道，此外杜仲皮和杜仲葉在傳統(tǒng)典籍中記載都可入藥，但是不同藥用部位所含成分不同，杜仲葉含有86種成分，其中有60種是其特有成分；杜仲皮含有107種成分，其中有78種是其特有成分。杜仲葉含有較多的環(huán)烯醚萜類成分，杜仲皮含有較多木脂素類成分[11-13]。就單體成分而言，杜仲葉中綠原酸含量較杜仲皮偏高，而京尼平苷酸、京尼平苷、京尼平及松脂醇二葡萄糖苷含量較杜仲皮偏低[14]。不同提取方式的提取物成分又有很大區(qū)別，多糖類化合物易溶于水，黃酮類化合物易溶于醇類溶劑[15-16]。為比較杜仲不同部位以及不同提取方式在HIRI中的藥理作用進行了以下研究，為杜仲防治HIRI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級大鼠48只，體質量（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學實驗動物中心，室溫22～26 ℃，明暗各12 h。本次實驗經遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 試劑及儀器

脂質氧化丙二醛（MDA）試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛購自北京麥瑞博生物科技有限公司；干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司），全波長酶標儀（Thermo，美國），高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司），生物顯微鏡（Leica，德國）。

1.3 杜仲提取物的制備

杜仲葉及皮購自當?shù)厮幉氖袌?，經遵義醫(yī)科大學姚秋陽副教授鑒定為杜仲正品。提取物制備方法參照高銀輝等[17]的方法進行，杜仲葉及杜仲皮水提取物制備方式為：將杜仲葉及皮分別磨成細粉，加入8倍體積蒸餾水后浸泡藥材2 h，之后加熱回流煮沸2 h，抽取溶劑留存，再加入8倍體積蒸餾水重復相同步驟1次，合并2次溶劑，過濾后使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮提取物。杜仲葉及皮醇提取物制備方法同水提取物類似，僅將蒸餾水替換為60%乙醇，旋轉蒸發(fā)濃縮至無醇味。將提取所得4種提取物保存于4 ℃冰箱中用于后續(xù)實驗。

1.4 動物分組及肝臟缺血再灌注模型的建立

48只雄性大鼠隨機分為6組：假手術組、HIRI模型組、杜仲皮水提取物預處理組、杜仲葉水提取物預處理組、杜仲葉醇提取物預處理組、杜仲皮醇提取物預處理組。4個預處理組分別使用對應的提取物于建立I/R模型前灌胃預處理10 d，1次/d， 提取物使用濃度依據前期研究結果設置為80 g生 藥/kg[18]。假手術組及HIRI模型組使用相同劑量生理鹽水按照相同方式灌胃操作。于灌胃開始第11天建立HIRI模型。具體方法為：術前12 h禁食，4 h禁水，使用10%水合氯醛（400 mg/kg）麻醉腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后將大鼠仰臥位固定于手術臺面，打開腹腔解剖肝胃韌帶暴露第一肝門，除假手術組外，其余5組使用顯微止血夾阻斷左肝葉及肝中葉血液供應，觀察缺血區(qū)域肝臟顏色變化，由鮮紅色轉為蒼白開始計時，1 h后取下止血夾，觀察大鼠缺血肝臟顏色開始恢復為紅色時關閉腹腔，再灌注時間為4 h。

1.5 標本采集

各組大鼠于肝臟再灌注4 h 時（假手術組為開腹后5 h）處死大鼠，下腔靜脈取血后室溫靜置2 h后4 ℃ 1 500 r/min離心15 min，取上層血清凍存于-80 ℃冰箱，送由遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科測定血清丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）。統(tǒng)一取大鼠左肝葉，部分缺血肝臟使用10%中性福爾馬林固定24 h后，送由遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科制作石蠟切片及HE染色，其余缺血肝臟存放于-80 ℃冰箱用于后續(xù)檢測MDA，SOD，TNF-α、IL-1β。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 大鼠HIRI 模型建立情況

各組大鼠均成功建立HIRI模型，建模過程中無大鼠死亡。左肝葉及肝中葉血流阻斷1 h后較未阻斷部分肝臟顏色明顯變暗，恢復灌注4 h后，原缺血區(qū)域血供恢復，和未缺血肝臟顏色無明顯差別（圖1）。

圖1 造模期間肝臟期顏色變化 A：未缺血時肝臟；B：部分肝臟阻斷1 h 時；C：再灌注4 h 時Figure 1 Color changes in the liver during model creation A: Liver before ischemia; B: Partial liver ischemia for 1 h; C: Reperfusion for 4 h

2.2 肝臟HE 染色

各組肝臟HE染色，HIRI模型組肝臟肝索結構較假手術組明顯紊亂，細胞腫脹，使用4種提取物預處理后均可明顯改善肝臟病理損傷，肝索結構紊亂及肝細胞水腫情況明顯改善，其中以杜仲葉醇提取物作用最為明顯（圖2）。

圖2 大鼠肝臟HE 染色（×200） A：假手術組；B：杜仲皮醇提取物預處理組；C；杜仲皮水提取物預處理組； D：HIRI 模型組；E：杜仲葉醇提取物預處理組；F：杜仲葉水提取物預處理組Figure 2 HE staining of livers of rats (×200) A: Sham operation group; B: Ethanol Eucommia bark extract pretreatment group; C: Water Eucommia bark extract pretreatment group; D: HIRI model group; E: Ethanol Eucommia leaf extract pretreatment group; F: Water Eucommia leaf extract pretreatment group

2.3 肝功能指標測定

4種杜仲提取物均可降低由HIRI導致的ALT、AST升高，尤以杜仲葉醇提取物作用效果最好，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖3）。

2.4 炎性指標

與HIRI模型組相比4種杜仲提取物均可降低由HIRI導致的TNF-α、IL-1β升高，尤以杜仲葉醇提取物降低效果最為明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖3 各組大鼠血清ALT、AST 水平 注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與HIRI 模型組比較，P＜0.05Figure 3 Serum ALT and AST levels in each group of rats Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs.HIRI group

圖4 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達水平 注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與HIRI 模型組比較，P＜0.05 Figure 4 Expression levels of TNF-α and IL-1β in liver tissue from each group of rats Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs.HIRI group

2.5 氧化應激指標測定

與HIRI模型組比較，4種杜仲提取物都可以通過降低MDA水平、升高SOD水平改善由HIRI導致的氧化應激損傷，尤以杜仲葉醇提取物改善作用最為明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組大鼠肝組織MDA、SOD 水平 注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與HIRI 模型組比較，P＜0.05Figure 5 MDA and SOD levels in liver tissue from each group of rats Note: 1) P＜0.05 vs. sham operation group; 2) P＜0.05 vs.HIRI group

3 討 論

外科手術是治療肝臟良惡性腫瘤和終末期肝病的有效方法，但伴隨而來的HIRI對患者術后恢復產生不利影響，甚至會導致死亡。預防HIRI的發(fā)生和發(fā)展是肝臟外科面臨的重大挑戰(zhàn)。以往的研究發(fā)現(xiàn)HIRI可分為兩個階段。首先，細胞內氧水平隨著缺血而降低，導致ATP合成紊亂和細胞代謝紊亂，同時ROS、細胞因子和黏附分子顯著升高，造成進一步的損傷[19-20]。其次，再灌注損傷，也是肝臟損傷和衰竭的主要時期。肝臟血流恢復后，缺血肝臟由代謝窘迫變?yōu)檫^度的先天免疫反應，在此階段大量中性粒細胞浸潤再灌注肝臟組織導致再灌注損傷[21]。

因HIRI病理過程的最終結果是導致肝組織結構破壞及肝細胞功能受損，故觀察肝組織形態(tài)結構及檢測肝功能是了解杜仲提取物對HIRI保護作用最直接的指標。本次實驗結果顯示4種杜仲提取物都可以改善由HIRI導致的肝臟結構損傷以及降低ALT、AST水平，其中以杜仲葉醇提取物效果最強（P＜0.05）。炎癥反應和氧化應激損傷是加重HIRI的兩個重要因素。MDA和SOD是反應機體氧化應激狀態(tài)的兩個重要指標， MDA是在ROS的作用下膜脂過氧化生成的重要產物之一，可間接反映組織過氧化損傷程度，其生成量與細胞受損程度成正比；而SOD是生物體內的一種抗氧化酶，在機體氧化與抗氧化平衡中發(fā)揮重要作用它可清除機體內的ROS，其活性高低與細胞氧化損傷程度成反比[22]。本次研究結果顯示4種杜仲提取物都可以通過降低MDA生成以及提高SOD活性在HIRI中減輕氧化應激損傷，其中以杜仲葉醇提取物作用效果最為顯著（P＜0.05）。HIRI發(fā)生發(fā)展過程中大量炎性因子產生，這些炎性因子可介導中性粒細胞黏附聚集，同時還參與肝組織結構損傷過程。IL-1β、TNF-α是在此過程發(fā)揮重要作用的兩種炎癥介質，是檢測機體炎癥反應的重要指標，也是判斷機體炎癥程度最常檢測的指標，其表達水平與機體炎癥損傷程度呈正相關[23]。本次結果顯示和HIRI模型組相比，4種杜仲提取物均可降低肝臟IL-1β、TNF-α表達水平（P＜0.05），尤以杜仲葉醇提取物效果較強。

本次實驗結果表明4 種杜仲提取物都具有改善HIRI的作用，其中以杜仲葉醇提取物效果最明顯，杜仲抗炎、抗氧化作用主要由酚酸類和黃酮類化合物介導。酚酸類化合物易溶于醇[24]，活性成分包含香草酸、咖啡酸、綠原酸等，尤以綠原酸報道較為常見，且杜仲葉中綠原酸含量遠高于杜仲皮[25]。現(xiàn)有研究[26-27]表明，綠原酸和咖啡酸可通過抗炎、抗氧化作用在HIRI中發(fā)揮保護作用，香草酸可以減輕心肌缺血再灌注損傷[28]。黃酮類化合物易溶于醇，主要存在于杜仲葉中，杜仲皮中含量較少，活性成分包括槲皮素和山柰酚等，杜仲中的黃酮類化合物可以提高SOD活性，是大多數(shù)氧自由基的清除劑[29-30]。Atef等[31]的研究表明懈皮素可以減輕中氧化應激反應對HIRI起到保護作用。

綜上所述，杜仲葉醇提取物對HIRI具有最顯著保護作用的原因可能為杜仲葉水提取物較其余三種提取物含有更多酚酸類及黃酮類化合物。本次實驗雖證實了杜仲提取物在HIRI中應用的可行性，為臨床防治HIRI提供一定參考，為開發(fā)傳統(tǒng)藥材提供一定依據，但亦存在一些缺點，未能確定各種提取物作用不同的準確原因，以及杜仲提取物在HIRI中發(fā)揮抗炎、抗氧化作用的具體途徑。杜仲在傳統(tǒng)典籍中一直習慣以杜仲皮入藥，對于資源豐富的杜仲葉利用度不高，在本次實驗結果中杜仲葉醇提取物在4種提取物中對HIRI保護效果最為顯著，表明在抗炎、抗氧化作用方面杜仲葉可以替代杜仲皮入藥，為杜仲葉的開發(fā)提供依據。