丁鵬敏，劉斯琪，龐月笙，王莎，玄振玉，張彤，王如峰*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.蘇州玉森新藥開發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215007；3.上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，上海 201203

小兒柴葛口服液是根據(jù)長期臨床實踐經(jīng)驗總結(jié)出的治療感冒的有效經(jīng)驗方研制而成的口服液制劑，具有解肌退熱、疏肝解郁、鎮(zhèn)痛抗炎之功效，用于治療小兒外感發(fā)熱。原方由柴胡(Bupleuri Radix)、葛根(Puerariae Lobatae Radix)、黃芩(Scutellariae Radix)、石膏(Gypsum Fibrosum)、青蒿(Artemisiae Annuae Herba)、白芍(Paeoniae Alba Radix)、炙甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata Cum Melle)7味中藥組成，其中柴胡性寒，具有疏散退熱、升舉陽氣、疏肝解郁之功效[1]，葛根性涼，具有解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉之功效[2]，兩者合為君藥；黃芩性寒，清熱燥濕、瀉火解毒[3]，為臣藥；白芍性涼、養(yǎng)血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗，與柴胡配伍和肝泄熱[4]，為佐藥；炙甘草性甘平，具有緩和藥性、調(diào)和百藥之功效，為使藥[5]。小兒柴葛口服液原方化學(xué)成分復(fù)雜，主要為黃酮類、皂苷類、萜類化合物。為了便于控制其質(zhì)量，提高其療效和保證用藥安全，本研究建立了其中10種主要成分3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷b2的HPLC含量測定方法，并采用多批次樣品進(jìn)行驗證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀及SPD-M20A型光電二極管陣列紫外可見光檢測器(Shimadzu，日本)；BT125D型十萬分之一天平(Sartorius，德國)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；IKA VORTEX GENIUS 3渦旋混勻器(IKA WERKE公司，德國)；Sigma 1-14小型臺式高速離心機(jī)(Sigma公司，美國)；Milli-Q純水儀(Millipore公司，美國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

處方中各藥材均購自北京同福堂大藥房，由北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定。對照品3′-羥基葛根素(批號：P28N8F49269，純度：99.7%)、葛根素(批號：T19M7F11461，純度：98.6%)購自上海源葉生物科技有限公司；3′-甲氧基葛根素(批號：PS15041701，純度：98.0%)購自成都普思生物科技有限公司；芍藥苷(批號：PRF9031342，純度：98.91%)、芍藥內(nèi)酯苷(批號：PRF9100921，純度：99.39%)、漢黃芩苷(批號：PRF10030443，純度：98.04%)、黃芩苷(批號：PRF9091201，純度：98.68%)、甘草苷(批號：PRF10041741，純度：99.37%)、柴胡皂苷a(批號：PRF9022503，純度：98.18%)、柴胡皂苷b2(批號：PRF9062242，純度：99.79%)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈和甲醇為色譜純(Thermo Fisher Scientific公司，美國)；磷酸為分析純(北京化工廠)；水為超純水(Milli-Q純水儀制備)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%～15%A；10～50 min，15%～42%A；50～60 min，42%～68%A)；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為230、210 nm；柱溫為30 ℃。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2對照品適量，分別加甲醇溶解，制備成質(zhì)量濃度分別為0.156、0.326、1.206、0.452、0.104、0.340、1.560、0.092、0.184、0.072 mg·mL-1的對照品溶液。

精密稱取3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2對照品適量，加甲醇稀釋至含3′-羥基葛根素0.006 mg·mL-1、3′-甲氧基葛根素0.017 mg·mL-1、葛根素0.042 mg·mL-1、芍藥苷0.022 mg·mL-1、芍藥內(nèi)酯苷0.019 mg·mL-1、漢黃芩苷0.019 mg·mL-1、黃芩苷0.057 mg·mL-1、甘草苷0.004 mg·mL-1、柴胡皂苷a 0.037 mg·mL-1、柴胡皂苷b20.014 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

按原方處方量，分別稱取柴胡6 g、葛根9 g、黃芩6 g、石膏12 g、青蒿9 g、白芍6 g、炙甘草3 g。石膏先煎30 min，再加黃芩煮沸殺酶10 min，然后加入其余中藥，加至10倍量水，水煎提取2次，每次1 h，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至500 mL。

取上述溶液1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，混勻，離心。取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1方法專屬性 分別精密吸取供試品溶液和混合對照品溶液各10 μL，按2.1項下色譜條件分析，結(jié)果見圖1，供試品溶液中可檢測到10個色譜峰，這些色譜峰與相鄰色譜峰都可達(dá)到基線分離，并且與對照品中色譜峰的保留時間一致，表明此方法專屬性良好。

注：A.對照品；B.供試品；1.3′-羥基葛根素；2.葛根素；3.3′-甲氧基葛根素；4.芍藥內(nèi)酯苷；5.芍藥苷；6.甘草苷；7.黃芩苷；8.漢黃芩苷；9.柴胡皂苷a；10.柴胡皂苷b2。圖1 混合對照品和供試品溶液的HPLC圖

2.4.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述各單一對照品溶液適量，用甲醇分別稀釋2、4、8、16、32倍，制成各對照品的系列對照品溶液。分別進(jìn)樣10 μL，按2.1項下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程和r分別為：3′-羥基葛根素Y=3.16×107X+9.06×104，r=0.999 5；3′-甲氧基葛根素Y=3.57×107X+2.47×105，r=0.999 2；葛根素Y=2.68×107X+5.17×105，r=0.999 3；芍藥苷Y=1.51×107X+1.21×105，r=0.999 4；芍藥內(nèi)酯苷Y=1.10×107X+2.06×104，r=0.999 0；漢黃芩苷Y=1.59×107X+1.00×105，r=0.999 0；黃芩苷Y=1.69×107X+4.43×105，r=0.999 2；甘草苷Y=2.37×107X+4.08×104，r=0.999 7；柴胡皂苷aY=2.36×106X+1.91×103，r=0.999 9；柴胡皂苷b2Y=7.34×106X+5.66×103，r=0.999 8。結(jié)果表明，3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2分別在0.005～0.078、0.010～0.163、0.038～0.603、0.014～0.226、0.004～0.052、0.011～0.170、0.049～0.780、0.003～0.046、0.006～0.092、0.002～0.036 mg·mL-1呈良好線性關(guān)系。

2.4.3精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。以峰面積計3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的RSD分別為0.43%、0.26%、0.21%、0.66%、1.40%、0.35%、0.31%、0.31%、0.37%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積計3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的RSD分別為0.50%、0.48%、0.48%、1.01%、1.71%、0.46%、0.22%、1.24%、0.43%、0.63%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5重復(fù)性試驗 按2.3項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。以峰面積計3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的RSD分別為0.79%、0.28%、0.23%、0.93%、1.14%、0.15%、0.21%、0.79%、1.58%、1.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6檢測限和定量限試驗 精密吸取2.2項下各對照品溶液適量，分別逐步稀釋進(jìn)樣至S/N=3和S/N=10，此時的進(jìn)樣量分別為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。經(jīng)測定3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的檢測限分別為0.25、0.33、0.21、0.61、0.75、0.69、0.64、0.35、4.74、0.98 ng，定量限分別為0.84、1.09、0.69、2.05、2.51、2.30、2.15、1.16、15.80、3.27 ng。

2.4.7回收率試驗 精密稱取原方組方藥材6份，分別精密加入各對照品溶液適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積，計算各對照品的回收率。3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、漢黃芩苷、黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的平均回收率分別為96.36%、96.56%、99.26%、97.20%、99.14%、96.29%、101.52%、102.30%、100.31%、99.62%，RSD分別為0.95%、0.98%、1.48%、1.10%、1.79%、0.81%、1.33%、1.71%、2.75%、1.52%，表明該方法的回收率良好。結(jié)果見表1。

表1 小兒柴葛口服液原方中10種成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.4.8樣品含量測定 取3批同法制備的供試液樣品，按2.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果見表2。

表2 3批小兒柴葛口服液原方中10種成分含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論與討論

本研究建立了小兒柴葛口服液原方中10種主要成分的含量測定方法，并測定了3批樣品中各化合物的含量，在測定的3批樣品中上述化合物的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.41、2.85、11.06、3.47、1.35、2.88、13.60、0.73、3.13、1.18 mg·g-1。3批樣品中對應(yīng)化合物的含量差別不大，說明本研究方法穩(wěn)定。

本研究中根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]比較了乙腈-水、乙腈-1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液3種不同的流動相系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相所得色譜峰的峰形和分離度較好。選擇3種不同柱溫即25、30、35 ℃進(jìn)行樣品分析，結(jié)果顯示，柱溫為30 ℃時，樣品色譜峰峰形較好，10種待測成分的分離度也較好。根據(jù)這10種化合物的二極管陣列檢測器(DAD)全波長掃描結(jié)果選擇檢測波長。葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素的最大吸收波長為248 nm，芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的最大吸收波長為230 nm，黃芩苷、漢黃芩苷、甘草苷的最大吸收波長為278 nm，柴胡皂苷b2的最大吸收波長為254 nm，而柴胡皂苷a僅在210 nm有末端吸收。綜合考慮這10種化合物能夠同時被測定，最終選擇230 nm(葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草苷、柴胡皂苷b2)和210 nm(柴胡皂苷a)雙波長進(jìn)行含量測定。

根據(jù)小兒柴葛口服液樣品的含量測定結(jié)果，上述10種化合物中黃芩苷含量最高，葛根素次之。黃芩苷和漢黃芩苷是單味藥黃芩中的2種黃酮類化合物，具有抗炎[9-10]、抗腫瘤[11-12]、解熱[13]、抗變態(tài)反應(yīng)等多種藥理作用。葛根素是葛根中的1種異黃酮類化合物，具有降血壓[14]、減緩心律、退熱、改善微循環(huán)等多重藥理作用。據(jù)文獻(xiàn)報道，葛根素水溶劑靜脈注射對發(fā)熱家兔有明顯的解熱作用，其解熱機(jī)制可能與它擴(kuò)張血管的作用有關(guān)[15]，目前已有葛根素注射液制劑應(yīng)用于臨床[16]。柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2是柴胡中的主要活性成分，具有解熱[17]、疏肝解郁[18]和鎮(zhèn)痛抗炎[19]等作用。其他成分如芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷是白芍中的主要有效成分，為單萜苷類化合物。有研究表明，兩者均可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮養(yǎng)血柔肝作用[20]。甘草苷是甘草中的1種黃酮類化合物，可以有效逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠的行為學(xué)改變[21]，具有抗抑郁作用。上述10種成分都是與小兒柴葛口服液原方的功效相關(guān)的成分，其總含量達(dá)到全方的4.19%，可以被視為其主要有效成分。本研究可為小兒柴葛口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。