張文芳，林碧珊，梁浩明，徐彤彤，胡梅，吳志權(quán)

國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303

國(guó)家藥典委員會(huì)在2016年發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》提出，中藥配方顆粒以標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為與臨床湯劑療效基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。深入開展標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜研究成為搭建藥材-飲片-提取物-配方顆粒全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量控制體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有助于中藥配方顆粒接軌歐盟注冊(cè)要求，實(shí)現(xiàn)中藥國(guó)際化。

防己為防己科植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore 的干燥根，具有祛風(fēng)止痛、利水消腫之功，主要用于風(fēng)濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒[1]。本研究建立防己藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC特征圖譜，為防己配方顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及歐盟注冊(cè)申報(bào)提供參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC 液相系統(tǒng)包括二元高壓泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器(Waters公司)；CORTECS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；MS105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水儀(Millipore公司)。

防己諾林堿對(duì)照品(批號(hào)：110793-201606，純度：98.8%)、粉防己堿對(duì)照品(批號(hào)：110711-201609，純度：99.2%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；木蘭花堿對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：150813，純度≥98%)；防己對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121279-201502)；無水乙醇為分析純；乙腈和磷酸均為色譜純；超純水由MILLIPORE純水儀制備。

15批防己藥材分別于2016年8月—2018年3月收集于江西和安徽不同種植產(chǎn)地，詳見表1，經(jīng)本單位質(zhì)管部黃國(guó)滿主管中藥師鑒定為防己科植物粉防己S.tetrandraS. Moore 的干燥根。由本實(shí)驗(yàn)室按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部炮制項(xiàng)要求制成同批號(hào)防己飲片，依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)指定技術(shù)要求(征求意見稿)》制備同批號(hào)防己標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

表1 15批不同產(chǎn)地防己樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[2-4]并對(duì)洗脫梯度、流動(dòng)相組成、檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱、柱溫、流速等系統(tǒng)適應(yīng)性條件進(jìn)行優(yōu)化，得到色譜條件如下，色譜柱：CORTECS T3 C18(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，洗脫梯度(0～3 min，0%A；3～5 min，0%～15%A；5～25 min，15%～30%A；25～29 min，30%～80%A)；流速：0.2 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：0.2 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取防己諾林堿和粉防己堿對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為19.9、300.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得；取木蘭花堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為141 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1防己藥材和飲片供試品溶液的制備 前期考察藥材特征圖譜供試品制備方法，發(fā)現(xiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》含量測(cè)定項(xiàng)所用2%鹽酸甲醇對(duì)防己諾林堿和粉防己堿的提取效果與30%乙醇一致，但對(duì)其他成分的提取效果不及30%乙醇，故選用30%乙醇作為提取媒介更能全面反映特征圖譜屬性。得到供試品溶液制備方法：精密稱取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.2 g，置具塞錐形瓶，精密量取30%乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率：500 W，頻率：40 kHz)處理30 min，取出，放涼，用30%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2防己標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.07 g，精密稱定，置20 mL量瓶中，加30%乙醇適量使溶解，超聲處理(功率：500 W，頻率：40 kHz)10 min，取出，放涼，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性 取木蘭花堿、粉防己堿和防己諾林堿參照物溶液進(jìn)行色譜峰標(biāo)定，比較保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖，確定樣品色譜圖中的峰歸屬。粉防己堿色譜峰為所有批次藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑所共有，其分離度良好，且為防己的藥效成分和專屬性成分，故以此為參照峰(S峰)，規(guī)定理論塔板數(shù)按粉防己堿峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

2.4.2精密度試驗(yàn) 取同批次防己供試品，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液各1份，在2.1項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，粉防己堿峰為參照峰，各共有峰所得相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次防己供試品共6份，按2.3項(xiàng)制備2組供試品溶液各6份，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，粉防己堿峰為參照峰，各共有峰所得相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同批次防己供試品，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液各1份，在2.1項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣，粉防己堿峰為參照峰，各共有峰所得相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品測(cè)定

按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液各0.2 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1～4。

注：A.木蘭花堿對(duì)照品溶液；B.混合對(duì)照品溶液；1. 木蘭花堿；2.防己諾林堿；3. 粉防己堿。圖1 木蘭花堿對(duì)照品溶液與防己諾林堿、粉防己堿混合對(duì)照品溶液的UPLC圖

圖2 15批防己藥材UPLC特征圖譜及其對(duì)照特征圖譜

圖3 15批防己飲片UPLC特征圖譜及其對(duì)照特征圖譜

圖4 15批防己標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜及其對(duì)照特征圖譜

2.6 共有峰的標(biāo)定

將各批防己藥材、飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑所得結(jié)果分別導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)，選擇時(shí)間窗寬度為0.10 min，平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，對(duì)色譜圖進(jìn)行多點(diǎn)校正后，自動(dòng)匹配，生成圖譜，經(jīng)分析比對(duì)后確定11個(gè)共有峰，見圖2～4。與木蘭花堿、防己諾林堿和粉防己堿對(duì)照色譜圖進(jìn)行比對(duì)，確定7號(hào)峰為木蘭花堿，10號(hào)峰為防己諾林堿，11號(hào)峰為粉防己堿。防己藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照特征圖譜見圖5。以峰11(粉防己堿)為參照峰，分別計(jì)算防己藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積(RA)，結(jié)果見表2。

圖5 防己藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC對(duì)照特征圖譜的比較

2.7 相關(guān)性分析

采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)所有色譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以均值法生成特征圖譜的共有模式，計(jì)算各批藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的相似度，結(jié)果見表3。15批防己藥材特征圖譜與對(duì)照特征圖譜的相似度為0.978～0.999；飲片為0.976～0.998；標(biāo)準(zhǔn)湯劑為0.962～0.999。表明藥材、飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑整體成分具有相似性，防己從藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑過程中各成分得到有效轉(zhuǎn)移。

3 討論

防己諾林堿和粉防己堿是防己藥材中主要的藥效成分和專屬性成分[5-6]。近年來有研究報(bào)道，通過比較防己水提物及其活性單體的毒效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)防己水提物的鎮(zhèn)痛效果更優(yōu)，粉防己堿作為防己的主要組分并不能夠完全表征防己的藥效；防己水提物停藥后的肝臟毒性可逆性是粉防己堿停藥后所不具備的，提示其水溶性強(qiáng)、極性大的生物堿類成分起了協(xié)同和持續(xù)的作用[7-8]。本研究通過防己藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜分析，確定11個(gè)共有特征峰，15批防己藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度分別大于0.90，相似度較高，表明防己從藥材經(jīng)過飲片制備，到標(biāo)準(zhǔn)湯劑其成分一致，三者特征圖譜具有良好的相關(guān)性；此外，研究組通過定量分析發(fā)現(xiàn)，15批防

表2 防己藥材、飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜分析

表3 防己藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度計(jì)算結(jié)果

己標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為10.4%～18.3%，2個(gè)藥效指標(biāo)成分粉防己堿和防己諾林堿的總量從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率為18.9%～39.3%?；诙恐笜?biāo)，結(jié)合特征圖譜可為防己配方顆粒的質(zhì)量控制提供更為科學(xué)的依據(jù)。以粉防己堿色譜峰為參照峰，分別計(jì)算防己藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰的相對(duì)峰面積，發(fā)現(xiàn)藥材和飲片各共有峰的RA值基本相符，但標(biāo)準(zhǔn)湯劑RA值有提高趨勢(shì)，主要原因可能是極性較大成分提取率較高，導(dǎo)致相對(duì)峰面積差異變大。